差速离心-蔗糖衬垫法提取柑橘线粒体dna

差速离心-蔗糖衬垫法提取柑橘线粒体dna

线条是一个重要的细胞。它相对独立于遗传物质的dna（mtsda）。根据大量遗传、细胞学和生物化学研究，细胞瘤（cm）的遗传因素主要分布在粒度中。因此，植物线条和植物阵线各组的高效化学分离是植物朱元璋分子机制的基础。目前用于高等植物mtDNA提取的方法有不连续蔗糖梯度超速离心法和差速离心法等。不连续蔗糖梯度超速离心法得到的线粒体DNA虽纯度高,但操作复杂、产率低,特别在吸取中间层黄色液时比较困难,不宜广泛采用,且长时间高速离心对离心机亦要求很高;普通的差速离心虽然操作简单,但所提取的mtDNA纯度低、易降解,以及核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染严重,不能满足后续研究工作的需要。本研究以柑橘胚性愈伤组织为材料,建立了一套快速高效的柑橘线粒体DNA提取方法,所提取的线粒体完整,具有很强的荧光活性;此方法提取的线粒体DNA,不但产率高、结构完整,而且能有效去除核DNA、RNA和蛋白质等杂质,能够满足后续研究需要,现将结果报道如下。1材料和方法1.1主要节点为阳无核哌柑,其重点在于格局4.本研究所选用的7份柑橘胚性愈伤组织材料和活体材料均取自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组和国家柑橘育种中心试验基地,即(1)黔阳无核椪柑(CitrusreticulataBlanco),(2)江西无核椪柑(C.reticulataBlanco),(3)国庆1号温州蜜柑(C.unshiuMarc.),(4)国庆4号温州蜜柑(C.unshiuMarc.),(5)伏令夏橙(C.sinensisOsbeck),(6)纽荷尔脐橙(C.sinensisOsbeck),(7)朋娜脐橙(C.sinensisOsbeck)。1.2线条的分离和纯度1组织粗粒沉降取培养15d左右正处于分裂期的胚性愈伤组织或叶片、黄化苗50g左右,加入3倍体积预冷的匀浆缓冲液A(0.2mol/L蔗糖、0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris-Cl、1mol/LEDTA、0.1%BSA、0.6%PVP、0.1%β-巯基乙醇,pH7.5),将预冷的组织用高速匀浆捣碎机破碎组织,低速2次,每次5s,高速3次,每次8～10s;10min后加入2倍体积缓冲液B(蔗糖0.3mol/L、50mol/LTris-Cl,pH7.5),静置20min,经4层纱布过滤,分装于8个50mL无菌离心管中;取滤液以3000r/min和4000r/min各离心10min,以除去组织碎片和质体;将上清液转入新的无菌离心管中,13000r/min离心10min,弃上清,得到粗线粒体沉淀;在每管沉淀中加入缓冲液C(50mol/LTris-Cl、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP,pH=7.5),用毛笔轻刷沉淀使之充分悬浮后收集至50mL无菌离心管内。2dnase纯化悬浮液4000r/min离心10min,上清液转入新的离心管中,加入DnaseⅠ至终浓度25μg/g,同时加入终浓度为0.01mol/L的MgCl2,冰上反应2h。在冰浴液中加入EDTA至终浓度20mol/L,终止DNaseⅠ反应;将此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介质上(0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris-Cl、0.6mol/L蔗糖,pH7.5),13000r/min离心10min。弃上清,沉淀中加入0.1mL/g的缓冲液C,轻轻悬浮均匀,再次将此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介质上,13000r/min离心20min,所得沉淀即为纯化的线粒体。上述操作均在2～4℃条件下进行。具体操作根据参考文献略作改动。1.3提取和提取瘦粉酶dna1rnasea酶液制备在线粒体沉淀中加入0.1mL/g缓冲液D(0.1mol/LTris-Cl、50mol/LEDTA、0.1mol/LNaCl、5%SDS、0.01mol/Lβ-巯基乙醇,pH7.5)轻轻混匀沉淀,再加入蛋白酶K至终浓度10μg/g,于65℃裂解1h,每隔10min轻轻摇动1次;加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)缓慢混匀,静置5min后,于4℃下10000r/min离心10min;取上清,加入RNaseA酶液至终浓度为100μg/mL,于37℃反应1h;加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),同时加入100μLKAc缓慢混匀,室温放置5min后,10000r/min离心10min;重复该步骤直至液面白色物质消失为止.2无定形法提取布放液液将上清液转入新的离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,充分混匀。将混合液分装到14个1.5mL无菌离心管内,-20℃过夜;将过夜的混合液在10000r/min、4℃条件下离心10min得到纯度较高的线粒体DNA;然后用70%酒精洗涤,线粒体DNA室温晾干后溶于30μLTE中,4℃保存备用。具体操作根据参考文献略作改动。1.4线条活性、线条dna质量和活性测试1物镜下观察取2μL纯化后的线粒体,以缓冲液B稀释20倍后取少量于40倍物镜下观察。其余稀释液加入荧光素(fluoresceindiacetateFDA)染色,吸少许滴到载玻片上,轻覆盖玻片,置于倒置荧光显微镜下进行荧光激发,观察照相以检测线粒体活性。2紫外分光光度计检测取10μLmtDNA溶液,加超纯水稀释至3mL,用紫外分光光度计分别测定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm及mtDNA浓度,并进行纯度分析。31测定了线条dna活性取5μLmtDNA样品,0.7%琼脂糖凝胶电泳90min(电压80V)。用凝胶成像系统照相检测mtDNA。1.5pcr扩增mtndaRAPD扩增体系参照文献介绍的方法。PCR反应体系为0.1mol/LdNTP;2mol/LMgCl2;0.4μmol/L引物;1.5UTaq酶;25ngmtDNA,总体系为25μL/管。PCR扩增程序为95℃3min1个循环;94℃1min,37℃1min,72℃2min45个循环;72℃5min1个循环;保存温度4℃。扩增反应在PTC-100(BIO-RAD,USA)上进行。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中,95V下电泳1h,然后在UVP成像系统(BIO-RAD,USA)上成像。2结果与分析2.1胚性愈伤组织的提取FDA是一种非极性物质,可被活细胞滞留,荧光激发后发出黄绿色荧光,若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光。本研究应用FDA染色来检测柑橘线粒体活性,40×光学显微镜下可观察到椭圆形的线粒体。线粒体经荧光素染色后荧光激发呈绿色(图1),说明提纯后的线粒体是完整的,具有一定的活性。应用本研究的方法从叶片(包括幼嫩叶片和成年态叶片)、黄化苗及胚性愈伤组织均可分离出线粒体,但进一步提取DNA发现:以叶片为材料获得的mtDNA量少、杂质多,且极易降解,即使用传统的纯化线粒体的方法(CsCl2超速离心),仍很难避免叶绿体DNA的污染。黄化苗虽然能够获得质量较高的mtDNA,但由于试材均为雄性不育品种,果实几乎无种子,黄化苗的获得较困难。而以胚性愈伤组织作为提取线粒体的材料,易扩繁,且能排除叶绿体DNA的污染,提取的mtDNA产率及质量均较高。从紫外分光光度计测定结果(表1)表明:以胚性愈伤组织提取的mtDNAA260nm/A280nm介于1.87～1.90之间,表明样品中无蛋白质或酚类污染,纯度较高,能够满足分析要求。样品平均浓度为1.90μg/μL,平均每克胚性愈伤组织可提取mtDNA1.90μg,即取30～50g胚性愈伤组织提取的mtDNA能满足分子标记技术分析研究的需要。mtDNA琼脂糖凝胶电泳观察到的带型清晰,mtDNA片段大小为20kb左右,未出现降解情况,无拖尾、弥散(图2),说明本方法能够得到纯度较高的大片段mtDNA片段。影响mtDNA提取产率的因素主要是线粒体的裂解程度。本研究发现5%SDS的裂解液与蛋白酶K一同处理效果最好,可能是因为高浓度的SDS与蛋白酶K共同作用更容易使线粒体膜裂解,利于mtDNA释放。同时,为了维持一定的渗透压,保证释放出的线粒体膜的完整性,笔者在缓冲液中加入了一定量的甘露醇,避免了在操作过程中线粒体提前裂解。用于mtDNA纯化的方法主要有KAc去除蛋白质法和有机溶剂去除蛋白质法等,但本试验采用这些方法效果并不理想。笔者在前人研究的基础上,对有机溶剂去除蛋白质的方法加以改进,即在V氯仿∶V异戊醇=24∶1抽提的同时加入100μLKAc,该方法能够较好地去除mtDNA中的蛋白质,所提取的mtDNA含杂质少,纯度较高。通过比较裂解温度和时间对mtDNA产率的影响,发现线粒体裂解时,在其他裂解条件不变的情况下,65℃裂解1h,所得到的mtDNA沉淀明显增多,原因可能是高裂解温度使线粒体破裂程度发生改变,从而引起mtDNA更多地释放出来。2.2rapd分析以黔阳无核椪柑、伏令夏橙和葡萄柚mtDNA为材料筛选合适的引物。对30条前期初筛的多态性好的随机引物进行筛选,其中14条引物扩增产物带型清晰,具有较好的多态性(图3)。本研究利用筛选出的14条引物对7份供试材料进行RAPD分析,获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后具有较好的多态性,大小在250～2000bp之间,且带型清晰,无拖尾现象(图4);共获得53条清晰的多态型带,每个引物扩增出1～6条谱带,平均为4条。研究发现,7份供试材料均能产生相同的扩增片段,说明mtDNA在进化上存在保守性序列,差异性扩增谱带的出现,说明各品种在mtDNA的碱基序列上存在多态性,品种之间存在进化关系。3rapd技术植物雄性不育性状是一种由细胞质基因控制的母性遗传性状,其实现是一个极其复杂的过程。从发现至今,人们对其发生机理的探索从未停止过,分子生物学的发展为人们从本质上认识CMS提供了有利的手段。国内外研究结果均表明,植物细胞质雄性不育与mtDNA变异有着密切的关系。但是,在植物中由于植物细胞具有细胞壁、大液泡和叶绿体DNA干扰,使mtDNA分离难度大大增加,因此,许多研究者亦从总DNA方面对胞质雄性不育进行了研究。该方法虽然能够说明部分问题,但是与胞质基因组相比,其结果不够直接、可靠。高等植物线粒体基因组的大小约为200～2500kb,结构比较复杂,存在大量的内含子、重复序列及非编码序列,不同于动物中只含有调控区和编码序列的线粒体基因组。在分子水平上对线粒体进行研究不仅能找出不同物种之间的亲缘关系,还可以克隆与某种特异现象有关的线粒体基因。目前用于mtDNA提取的方法主要有氯化铯梯度超速离心法、蔗糖密度梯度离心法和差速离心法等。氯化铯梯度超速离心法获得的mtDNA纯度高,可以在一定程度上避免叶绿体DNA的污染,但是该方法费用较高,不适合普通实验室操作;蔗糖密度梯度离心得到的mtDNA纯度虽高,但操作复杂、耗时、对材料的需求量大,同时mtDNA的产率低,且长时间高速离心对离心机的要求也较高;普通的差速离心法虽然操作简单,但所提取的mtDNA纯度低、易降解,且核DNA、蛋白质等杂质污染严重,不能满足后续研究工作的需要。本研究采用的方法是综