高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中伏立康唑浓度

高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中伏立康唑浓度

福立康唑是一种新型的三醇抗真菌药物。由于其低耐率和高抗菌谱，它现在被广泛用于治疗入侵者的细菌感染。伏立康唑通过肝脏细胞色素P450同功酶CYP2C19,CYP2C9和CYP3A4代谢,体内研究表明CYP2C19在伏立康唑的代谢中起重要作用。而CYP2C19具有基因多态性,从而可能导致伏立康唑的药动学个体差异较大,有必要对其进行治疗药物浓度监测,以提高伏立康唑应用的安全性和有效性。1高速冷冻离心设备Agilent1200LC/6410BMS液相色谱/串联四级杆质谱联用仪;AllegraTM64RCentrifuge台式高速冷冻离心机(BeckmanCoulterTM);AS3120超声波发生器(AutoScience公司);对照品伏立康唑(中国食品药品检定研究院,批号100862)及内标酮康唑(中国食品药品检定研究院,批号100294);甲醇、乙腈、醋酸铵试剂均为分析纯。2方法和结果2.1条件12.1.1流动相、流动相、流动相的测定色谱柱:ThermoC18柱(2.1mm×150mm,2.4μm),流动相:乙腈-0.01mol·L-1醋酸铵溶液(90∶10),流速:0.3mL·min-1,进样量:1.0μL,柱温:35℃。2.1.2数据分析参数离子源为电喷雾(ESI)离子源,正离子电离模式,干燥气(N2)温度350℃,雾化气(N2)压力275.8kPa,干燥气(N2)流量9.00L·min-1,电喷雾电压4000V,扫描方式为多反应监测(MRM)模式。在此条件下对照品伏立康唑及内标酮康唑的分析参数分别为:伏立康唑保留时间为1.5min,母离子m/z为351,用于定性及定量的主要子离子m/z分别为281和127,源内碎裂电压为135eV,子离子碰撞能量均为20eV;内标酮康唑保留时间为2.3min,母离子m/z为531,用于定性及定量的主要子离子m/z分别为82和489,源内碎裂电压为135eV,子离子碰撞能量分别为和36eV和32eV。在此条件下,对照品伏立康唑及内标酮康唑的二级离子碎片图如图1。2.2其他抗真菌药经我院伦理委员会同意后选出10名临床上疑似或临床诊断或确诊为侵袭性真菌感染的患者,并且这些患者已经选用伏立康唑治疗。排除合并使用其他肝药诱导剂(如利福平、苯妥英等)或肝药酶抑制剂(氟喹诺酮类、大环内酯类、其他三唑类抗真菌药)及其他可能影响患者体内伏立康唑血药浓度的患者;肝肾功能中、重度异常患者。用药方法:首日400mg/次,bid;以后200mg/次,bid,待伏立康唑用药3d后,于下次给药前0.5～1h抽取患者外周静脉血2mL,保存于肝素钠抗凝管中,-20℃冷藏备用。2.3溶液的制备和标准曲线的制备2.3.1对照品溶液的制备分别称取标准品伏立康唑和内标酮康唑10mg,用甲醇溶解并定容至100mL。分别得质量浓度为0.1mg·mL-1的伏立康唑和内标酮康唑标准储备液,置4℃冰箱中保存备用。临用时用甲醇将伏立康唑标准储备液稀释为0.1、1、2.5、5、7.5、10μg·mL-1的伏立康唑系列对照品溶液;并将酮康唑内标溶液用甲醇稀释至1μg·mL-1。2.3.2采用hplc-ms/ms方法,提取伏立康唑,把其作为复配体系中的一种药物,其复归一般市场化用,其符合以下步骤称取空白血样0.5mL,置于5mL量瓶中,首先加入0.5mL质量浓度为1μg·mL-1内标溶液,然后再分别加入“2.3.1”项下伏立康唑的系列浓度对照品溶液0.5mL,再用甲醇定容至刻度,超声波提取处理5min后,转入离心管中,3000～4000r·min-1离心5min,取上清液过0.20μm微孔滤膜后,进样1.0μL,HPLC-MS/MS测定。以伏立康唑质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标,伏立康唑与内标酮康唑峰面积比值Y为纵坐标,得回归方程:Y=28.618X-0.063(r=0.9999)。伏立康唑线性范围为0.1～10μg·mL-1。2.4方法的回收率及色谱图精密量取已放置至室温的患者血样0.2mL,置于5mL量瓶中,加入0.5mL质量浓度为1μg·mL-1内标溶液,再用甲醇定容至刻度,超声波处理5min后,转入离心管中,3000～4000r·min-1离心5min,上清液过0.20μm微孔滤膜,制得待测样品溶液。取样品溶液及含有内标酮康唑的标准溶液各1.0μL进样,HPLC-MS/MS测定。选取用于定性及定量的主要子离子为检测目标,进行扫描,对照品溶液及待测样品溶液的总离子流色谱图如图2;对照品溶液及待测样品溶液的特征离子流色谱图如图3。2.5方法研究2.5.1样品溶液的制备取同一血样,在-20℃条件下放置20d并反复冻融3次,按“2.4”项下处理方法配制样品溶液并进样测定。结果首次测量结果及放置20d内3次冻融后测量结果的RSD为3.02%。2.5.2内标含量对伏立康唑峰面积比值的影响各取含低、中、高不同伏立康唑浓度的血样,按“2.4”项下方法加入内标溶液,同法处理,连续进样6次,结果低、中、高不同浓度伏立康唑与内标酮康唑峰面积比值的RSD分别为3.55%、2.56%、2.18%。2.5.3重复试验取同一患者血浆共5份,按“2.4”项下方法加入内标溶液,同法进样。结果伏立康唑与内标酮康唑峰面积比值的RSD为2.89%。2.5.4对照溶液的制备吸取空白血样0.5mL共3份,分别置于5mL量瓶中,然后再按“2.4”项下方法分别加入质量浓度分别为2、25、75μg·mL-1伏立康唑的系列对照溶液及质量浓度为1μg·mL-1酮康唑内标溶液各0.5mL,按“2.4”项下方法处理,制得样品溶液;另取质量浓度分别为2,25,75μg·mL-1伏立康唑的系列对照溶液及质量浓度为1μg·mL-1酮康唑内标溶液各0.5mL直接置于5mL量瓶中,甲醇定容,过滤后直接进样。将伏立康唑/酮康唑血浆样品的峰面积比值与相应浓度峰面积比值相比较,计算绝对回收率分别为99.6%、98.5%、98.2%。2.6患者静脉血的诊断本研究共抽取10例使用伏立康唑治疗的患者的静脉血,其中拟诊5例,临床诊断4例,确诊1例。其临床资料、伏立康唑血药浓度及药物不良反应的发生情况见表1。3血药浓度与不良反应的关系文献报道伏立康唑的血药浓度检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(HPLC-MS),但目前国内主要用于药动学研究或生物等效性的研究。两者相比,HPLC法由于样品的前处理比较复杂,样品检测时间长,专属性相对较差。在实际的临床工作中,由于使用伏立康唑的患者大多病情危重,合并使用的药物较多,干扰因素多,因此如果采用HPLC法会造成样品前处理繁琐,分离不完全,检测时间长,从而影响检验结果的准确性及有效性。而本研究采用HPLC-MS/MS法则可有效地弥补HPLC法的不足之处,样品的前处理简单,实验的专属性强,灵敏度高,可快速、准确地向临床提供检测结果。伏立康唑临床不良反应发生率较高,如疑横纹肌溶解症、肝功能损害、造血系统损害、视觉异常等,本实验基于这样的推测:其不良反应的发生可能与患者较高的血药浓度有着某种关联性。国外有研究显示:伏立康唑药动学的个体间差异很大,其治疗效果与体内血药浓度密切相关,有必要进行治疗药物浓度监测(therapeuticdrugmonitoring,TDM)。另研究发现,在造血干细胞移植患者中,服用标准剂量的伏立康唑因为药物代谢个体差异而导致伏立康唑谷浓度范围从0.2～6.8μg·mL-1不等,伏立康唑血药浓度方面的差异不可预知,血药浓度与剂量之间的线性关系不明显(r=0.14;P=0.045),服用标准剂量的伏立康唑,大约有1/4～2/3的患者可能由于血药浓度低于治疗浓度范围而导致治疗失败。建议对于长期需要伏立康唑治疗的患者进行血药浓度监测。从药物不良反应角度看:肝毒性是包括伏立康唑在内的三唑类抗真菌药物的不良反应之一,其发生率相对较高,其他常见的不良反应包括视觉障碍、发热、皮疹、骨髓抑制等。药效学研究已经证实了伏立康唑血药浓度与肝毒性有必然联系。伏立康唑的血药质量浓度每增加1μg·mL-1,肝功能受损的风险就会增加7%～17%。以上研究都证明了伏立康唑具有与基因多态性相关的明显的药动学个体差异及存在血药浓度-疗效、血药浓度-不良反应相关性。目前国内外尚没有确定的伏立康唑治疗药物浓度范围,国外推荐的范围为1～6μg·mL-1。本研究对10例临床使用伏立康唑的患者进行血药浓度检测,发现3例患者的血药浓度偏高,4例患者出现不同程度的不良反应,其中转氨酶异常、视觉反应是其较为常见的不良反应;但视觉异常在静滴过程中较容易出现,可能与伏立康唑的谷浓度没有必然联系,而与其峰浓度有更大的相关性;患者出现红斑皮疹与伏立康唑有较高光敏性有关。目前药品说明书中尚没有对伏立康唑滴速方面的要求,建议:为减少其视觉损害的发生率,静滴伏立康唑时尽可能降低滴速或使用大容量液体稀释,以降低其峰浓度。通过对10例患者的伏立康唑血药浓度检测,并结合临床分析,可认为伏立