复方酮康唑喷膜治疗豚鼠湿疹的疗效观察

复方酮康唑喷膜治疗豚鼠湿疹的疗效观察

湿热是一种具有复发、强烈瘙痒和广泛损伤特点的过敏性皮肤疾病，其病因复杂。其发生主要取决于致敏物的致敏特性和宿主对外源性致敏物的反应。致敏物穿过皮肤,Langerhans抗原提呈细胞(LC)携带致敏物离开表皮迁移至淋巴结,进入副皮质区。LC在迁移途中将致敏物加工,使其能与细胞表面HLA-DR分子相连,到达淋巴结,LC将致敏物提呈给T淋巴细胞,T淋巴细胞一旦识别致敏物和HLA-DR便建立免疫记忆,Th1细胞调节变态反应产生IL-2和干扰素-γ。敏感性诱导和免疫记忆需8～14天。再次暴露于致敏物,LC将其携带至真皮T记忆细胞,变态反应激活释放细胞因子攻击其他细胞,导致变态反应性湿疹的炎症反应。Spergel和Wang等应用卵清蛋白(OVA)反复激发敏感性小鼠皮肤成功地制备了豚鼠湿疹模型。这一模型与目前对湿疹发病机制的认识较为一致,因此,本实验采用OVA制备豚鼠湿疹模型来观察复方酮康唑喷膜对湿疹的疗效。1地塞米松霜组elisa-pcr1.1药物与材料OVAIII级(上海生物工程公司,批号:3049),十二烷基磺酸钠(SDS,上海化学试公司),Al(OH)3(金山兴塔化工厂),戊巴比妥(上海化学试公司),白凡士林(上海华永石蜡有限公司);复方酮康唑喷膜(自制);地塞米松止痒霜(本院制剂,主要成份为0.05%地塞米松,樟脑,薄荷脑)。1.2复方酮康唑喷膜制备1.2.1处方组成酮康唑10g,醋酸地塞米松0.5g,壳聚糖盐酸盐10g,吐温-8010g,水溶性硅油10g,尼泊金乙酯适量,乙醇适量,纯化水适量,共制成1000ml。1.2.2制备工艺取处方量的壳聚糖盐酸盐加适量纯化水胀溶;取处方量酮康唑、醋酸地塞米松加乙醇溶解,加适量尼泊金乙酯,再加入吐温-80,将上述醇溶液搅匀,缓慢加入壳聚糖盐酸盐溶液中。最后加水溶性硅油,搅匀,分装于60ml喷瓶,密闭,即得。1.3湿疹模型制备取4～5周龄健康雌性豚鼠25只(本校实验动物中心),体重232.4±32.95g,在每只小鼠背部两侧去毛4处,面积2cm×3cm/处。按体重戊巴比妥腹腔注射麻醉;在剃毛处皮内注射OVA10μg+Al(OH)30.5mg;1周后,用3cm×4cm纱布,涂上10%OVA+10%SDS+30%凡士林+50%水,贴于剃毛处保持48h;皮内注射后第3周,再用3cm×4cm纱布,涂上10%OVA+5%SDS+37%凡士林+48%水,贴于剃毛处保持48h;休息1周,用1cm×1cm双层纱布,涂上10%OVA+20%水+70%凡士林,贴于剃毛处保持24h,做抗原激发反应。48h后对红斑、水肿、抓痕进行评分,计算总分。1.4分组与给药方法样本总数100个,随机分为A,B,C,D,E五组(N=100,n=20)。激发后即开始给药,A,B,C组给予复方酮康唑喷膜(其中含地塞米松浓度分别为0.10%,0.05%,0.025%),2日1次;D组给予地塞米松止痒霜,2次/d;E为空白对照组。于用药后48h,1,2,3周对各组进行疗效评价。1.5评价指标1.5.1症状评分标准红斑:无为0分,轻微为1分,明显红斑无痂皮为2分,中重度红斑伴轻中度痂皮为3分,重度红斑伴重度痂皮为4分;水肿:无为0分,轻1分,中、重度为2分;抓痕:无为0分,有为1分。1.5.2组织学观察抗原激发后48h取15mm×1～2mm皮肤活检(包括正常与病损皮肤);固定于10%中性缓冲福尔马林液中;4μm石蜡切片,用HE染色和Biebrich苏丹铁染色(Luna染色),观察组织病理变化和嗜酸性粒细胞浸润情况。1.6统计学处理所有数据用,多个样本比较采用秩和检验(Kruskal-Wallis法),两两比较采用Dunett’s检验,组内比较采用配对秩和检验。P<0.05为显著意义。统计数据用SAS软件包处理。2结果2.1克氏原螯虾组织病理组织形态豚鼠背部OVA激发后48h出现湿疹样反应,表现为不同程度的弥漫性红斑、水肿、抓痕伴血痂,边界不清,其上少许粟粒状丘疹,部分有渗出(图1)。变态反应激发后48h组织病理以表皮肥厚,表皮真皮炎性细胞浸润为特征。激发部位表皮增厚,细胞约4～6层,颗粒层、棘层细胞水肿、囊泡形成和表皮结痂。表皮和真皮大量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润,大多数炎性细胞聚集于真皮乳头层和深层(图2a,b,c,d)。平均嗜酸性粒细胞计数:102±7.8个/mm。2.2治疗前后两组黄斑、水肿和总引物比较用药第5天,A,B,C,D组豚鼠背部红斑颜色变淡,轻度水肿,有少许抓痕和血痂;E组背部红斑弥漫,边界不清,轻度水肿,抓痕血痂明显,粟粒样丘疹,有渗出倾向。用药第7天,A,B,C,D组红斑缩小,水肿消退,少许痂皮,抓痕陈旧;E组症状无改善(图3a,b,c,d,e)。用药第14天,A,B,C,D组红斑消退,色素加深;E组红斑缩小,边界不清,少许粟粒样丘疹,伴抓痕。治疗7天时,比较各组评分结果,其中A,B,C,D四组治疗前后组内红斑、水肿和总分比较差异有显著性(P<0.05),各组与E组比较,差异有显著意义(P<0.05),四组抑制率均在50%左右;而E组组内比较差异无显著性P均>0.05,,抑制率仅12.5%(表1～4)。3已发生有效药物的多次给药对大鼠长期皮肤长期毒性的影响复方酮康唑喷膜是以1%壳聚糖盐酸盐为成膜辅料,以酮康唑和醋酸地塞米松为主药配伍制成的缓释喷膜,能同时起到抗真菌、抗炎、抗过敏及止痒作用。该药呈液态,微粘稠,容易通过高压喷头,成膜快,膜柔韧,弹性好。药液喷出后,能迅速形成一层薄膜,覆盖创面,减少皮肤表面水分蒸发,促进水合作用和溶解角质作用,药物缓慢释放。本研究旨在观察该药对湿疹动物模型的疗效。迄今为止,有关湿疹动物模型的研究甚少,这给湿疹的发病机制和临床诊治研究带来困难。有作者参照斑贴试验,在特应性皮炎患者皮肤上应用过敏原激发湿疹样反应。Matsuoka等应用尘螨作为抗原反复激发NC小鼠产生湿疹样反应。金慧玲等则用二硝基氯苯反复激发小鼠背部皮肤制作了慢性接触性湿疹。近年,Spergel和Wang等应用OVA反复激发敏感性小鼠皮肤成功地制备了鼠湿疹模型,这一模型与目前对湿疹发病机制的认识较为一致。因此,本实验参照Spergel和Wang的方法采用OVA激发敏感豚鼠皮肤制备豚鼠湿疹模型。湿疹是一种变态反应性炎症,具体病因不明,目前治疗多以糖皮质激素加对症处理为主,但难以避免复发。近来研究发现,湿疹与患者皮肤的微生物携带密切相关。Jones等首次报道特应性皮炎(AD)与皮肤癣菌感染的关系,发现AD患者皮肤癣菌感染率高达41%。而Wilson等发现,变态反应性疾病合并皮肤癣菌感染患者抗真菌治疗能改善变态反应性疾病的症状。上述研究提示,湿疹可能也与某些细菌真菌密切相关。因此,对于湿疹局部治疗,合并应用抗细菌、抗真菌药物比单独应用激素更合理。本组制成的复方酮康唑缓释喷膜,很可能同时达到以上治疗目的,起到抗真菌、抗炎、抗过敏及止痒作用。本结果显示,复方酮康唑喷膜治疗7天时,各治疗组治疗后评分明显下降,明显优于空白对照组,而与地塞米松止痒霜组比较无显著意义,但复方酮康唑喷膜给药次数明显少。不同地塞米松浓度酮康唑喷膜组间比较虽无明显差别,但中等浓度地塞米松组总