动物细胞培养

动物细胞培养技术

实验报告小组成员：孙显鹏孙夏慧孙崇军刘万喜石仁兴刘旭峰李亚腾马英达班级：生技1204 组号：三组指导老师：张玉喜2015年6月20日动物细胞培养准备实验目的:了解并掌握动物细胞培养中使用的仪器设备及其清洁使用方法：了解各种试剂配制方法实验原理：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。仪器与设备：各种型号培养瓶、培养皿、医用解剖用具（解剖剪，解剖镊）倒置显微镜，枪头一盒，100目及200目铜滤网各3个、培养皿大小各一个、100ml培养瓶及塞子、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、酒精一壶、玻璃棒几个、高压灭菌锅、无菌操作台、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、记号笔一个/组，注射器、过滤器。实验步骤：仪器准备1、 玻璃器皿简单刷洗并甩十2、 金属滤网剪切，并与合适烧杯配套组合为滤器3、 1.5mlEP管装瓶，枪头装盒仪器消毒：（一） 包装1、 包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。2、 瓶类：用报纸包扎。随后单个或几个一起用纸包好。3、 带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。4、 为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“一” “+”。（二） 器皿的消毒湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121r时算起。一般蒸气消毒30分钟。橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。溶液配制：（一） DMEM培养液取一包DMEM试剂（13.5g）溶于800ml双蒸水中，调节PH至7.4，加入抗生素0.1g,双蒸水定容至1L，搅拌均匀，等待过滤除菌。（二） 胰蛋白酶液胰蛋白酶是一种黄白色粉末，水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架.从而使细胞分离。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250两种，即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25%，作用温度37°C或室温，pH7.4左右。Ca2+Mg2+和血清的存在都会降低其活力。0.25%胰蛋白酶液的配制方法如下称取0.25g胰蛋白酶溶于100ml双蒸水中，搅拌均匀，等待过滤除菌（三）Hanks液（已提前配制好），等待过滤除菌过滤除菌及分装注射器安装滤器，吸取各类试剂后分装至相应瓶中试剂存放及器材整理所有分装试剂置于4C冰箱中保存，已备后续实验使用。注意事项：过滤除菌时严格使用无菌操作。尽量减少试剂在空气中的暴露时间。根据配量准备分装瓶和瓶塞，分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。融化后的液体置4C保存。分装前做好分装量标记，分装瓶内液体量要小于瓶容积的2/3。做好分装瓶标记，包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。实验二细胞的原代培养实验目的：了解并掌握原代培养的原理了解原代培养过程中的操作及试剂使用实验原理：从供体获取组织细胞的首次培养叫原代培养或初代细胞培养。原代细胞离体时间短，具有二倍体遗传性，在一定程度上能反映体内的生长特性，很适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。根据不同的实验目的、不同的实验材料，解离或分离细胞的方法和条件各有不同。一般常用方法有二:一是组织块培养法；二是单层细胞培养法。本实验主要采用胰蛋白酶消化法，对初生乳鼠肺组织进行原代培养。实验材料：材料；4周龄新生乳鼠药品：DMEM培养液，小牛血清（FCS），0.25%胰蛋白酶，器材：培养瓶，1.5mlEP管，培养皿1套/组，移液枪，剪子1把/组，镊子2把/组，滤器，酒精灯设备：离心机、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、超净工作台、二氧化碳培养箱实验步骤：取材将4周龄新生乳鼠断髓后，将尾巴提起，鼠身浸入75%酒精的烧杯中旋转3s左右（默数5下），取出放在灭菌的培养皿中，移入工作台内。小鼠仰位固定在培养皿上。在胸廓正中线中位处，用两把眼科弯镊（第1套器械）夹起皮肤，向左右两侧头端撕拉，膈肌部位皮肤向尾端拉，皮肤外翻固定，躯干部肌肉暴露（注意：不要使表皮面接触胸腹肌）。酒精消毒后，沿着膈膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断（第II套器械）。胸廓暴露后，可见心脏和粉红色肺。将眼科镊弯头端向上（第III套器械），将肝脾肾一齐取出，移入已加Hanks液的培养皿内。漂洗用Hanks液漂洗肝脾肾表面血污，然后粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次后，吸去多余液体。研磨取不同器官分别在100及200目滤器上研磨，并吸取2mlHanks液冲洗全滤器的烧杯中。取烧杯中研磨液1.0ml至1.5mlEP管中，配平离心，700rpm离心10min取上清全培养瓶中，吸取10ml培养液至培养瓶中，使液面高度至3.0mm左右。将培养瓶放置于二氧化碳培养箱中培养7.24h后即可观察实验三观察肝100目肝200目脾100目脾200目肾100目肾200目实验四细胞的传代培养实验目的:了解并掌握传代培养的原理了解传代培养中各试剂的使用及操作实验原理：传代培养是组织培养常规保种方法之一。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。原代培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则会因细胞密度过大，或生存空间不足、营养不够导致细胞衰老、停止生长甚至死亡。细胞的再培养，即将原代培养瓶内的细胞分离、稀释、接种到新培养瓶|内继续扩增培养。原代培养的首次传代称为第二代，是建立细胞系的关键时期。首次传代时，细胞接种数量要多，使细胞尽快适应新环境，有利于二细胞的生存和增殖。通常，原代细胞按1：2分种传代。生长快的细胞系（株）按1：4分种传代。根据细胞生长特点，传代方法有三种：悬浮生长细胞传代；半悬浮生长细胞传代；贴壁生长细胞传代。实验材料1、 材料原代培养的细胞（肝或肾或脾细胞）2、 仪器与用具二氧化碳培养箱、倒置显微镜、超净工作台、移液枪、酒精灯。3、 试剂培养液，Hanks液，胰蛋白酶液实验步骤生长良好的原代肝或肾细胞，一般经过7d左右可形成致密单层细胞。倒去原瓶培养液，用1mlHanks液洗一遍（若需收集分裂细胞，则轻轻振动培养瓶。将贴壁疏松的有丝分裂球形细胞振人培养液内，最后移入离心管中）。消化。向培养瓶细