蕨类植物组织培养的研究进展

蕨类植物组织培养的研究进展

蕨类植物也被称为羊齿草，起源于古代的志留纪和泥盆纪。在石炭系，他是植物界的主人，但在那之后，它大多消失，只有一部分发展成为现代蕨类植物。蕨类植物的分类地位介于苔藓植物和种子植物之间,目前全世界约有12000多种,主要分布在热带和亚热带地区,中国有2600多种(秦仁昌,1959)。蕨类植物以其高雅飘逸的体态、碧绿青翠的叶片以及精致的脉序、孢子囊群的排列组合构成的精美图案,成为观叶植物的一大类族。目前观赏应用的种类主要有:铁线蕨(Adiantumcapillusveneris)、肾蕨(Nephrolepiscordifolia)、凤尾蕨(Pteriscretica)、巢蕨(Aspleniumnidus)、鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)、鳞盖蕨属(Microlepia)、多足蕨属(Polypodium)、骨碎补属(Davallia)、旱蕨(Pellaeanitidula)和紫萁(Osmundajaponica)等(Olsen,2007)。蕨类植物具有明显的世代交替,即大而复杂的二倍体孢子体世代(无性)和小而简单的单倍体配子体世代(有性),无性世代和有性世代都可独立生活;但占优势的是孢子体,即孢子体世代(陆树刚,2007)。自然条件下,蕨类植物主要通过孢子进行繁衍,或通过根、根状茎、叶等部位产生无性芽孢和顶端分生组织产生新植株。然而,自然繁殖的蕨类植物远远不能满足人类的需求,而且近年来生境恶化及掠夺式的开发使蕨类资源急剧减少,甚至有些种类在原产地已经灭绝(傅立国,1992)。组织培养已经作为一种有效的快速繁殖手段运用于蕨类植物生产中,通过组织培养方式进行繁殖对于一些无孢子或孢子量少、孢子不育的杂交种以及孢子繁殖困难的种类尤为适宜(石雷,2002)。此外,对于蕨类植物物种,尤其是濒危物种桫椤(Alsophilaspinulosa)的保存也具有重要意义,利用无菌保存(配子体或孢子体)可以在不受自然条件影响下,在有限空间保存大量种质资源。1pla对蕨类植物的细胞培养蕨类植物的组织培养主要以孢子和孢子体(根状茎、匍匐茎、嫩叶)为外植体。国外对观赏蕨类组织培养进行了广泛的研究,波士顿蕨(Nephrolepisexaltala‘Bostoniensis’)已经成为第一个商业性快繁的观叶植物(Hartmanetal.,1986)。中国对观赏蕨类的组培研究近年才开始。以孢子为外植体进行组织培养即是在无菌培养条件下模拟自然环境中孢子发育的过程。在自然条件下蕨类植物通过叶腋及叶背产生的孢子进行繁殖。孢子萌发是配子体世代开始的标志,而判断孢子萌发的标志是初生假根或原叶体细胞的出现或者同时出现,原叶体形态经历丝状、片状、心形等过程,在它的中部有一个较厚的伸长结构分化形成颈卵器和精子器,在其下表面有假根。在有水的条件下颈卵器中的卵子和精子器中的精子受精形成合子,合子发育成胚,进而形成幼小孢子体(邵莉楣,1994)。目前在蕨类植物中许多种类已利用孢子进行组织培养获得成功,由于蕨类植物生活史与种子植物有很大差别,因此,在孢子培养过程中所需条件亦不尽相同(李文安和王玉琴,1990)。此外,孢子繁殖受很多因素影响:孢子的发育能力和储存方式、培养基、土壤表面及孢子和土壤的灭菌、孢子的大小、播种密度及配子体和孢子体相互作用等(Fernández&Revilla,2003)。对于那些没有孢子的种类,如波士顿蕨,则不能使用孢子作为外植体进行组织培养。以孢子体为外植体即通过将蕨类的根状茎、嫩叶、匍匐茎、侧枝、托叶、块茎、根芽、鳞芽、茎尖等诱导为愈伤组织、不定芽、绿色球状体(greenglobularbodies,GGB)进行增殖,快速且取材不受季节限制。2加工过程模型采集的成熟孢子需先干燥1~2d,4℃低温保存。接种的孢子需先在70%酒精中消毒几秒,然后转入升汞溶液或者次氯酸钠中消毒2min,用无菌水漂洗几次。为了消毒更彻底还可以使用表面活性剂,如吐温。接种的孢子一般2~4周萌发,但有些种类,如桫椤(Alsophilaspinulosa)、狼尾蕨(Davalliabullata)、鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)的孢子有休眠特性,可以用GA3预处理2~5min使之打破休眠(李文安和王玉琴,1990;程治英等,1991;Lietal.,2010)。3培训条件3.1原叶体的生长孢子萌发培养基一般采用MS为基本培养基。但有些种类在全培养基中不能萌发,只有在稀释的MS、Knudson、Knop等低盐培养基中才能萌发。欧紫萁(Osmundaregalis)孢子在低氨浓度的培养基(Knop、Knudson或者1/4MS培养基)中生长最适(Fernándezetal.,1997a)。分枝莎草蕨(Schizaeadichotoma)孢子最高的萌发率(34%)也出现在1/4MS培养基中(Jasonetal.,2003)。紫萁(Osmundajaponica)孢子在1/8MS培养基中萌发率可达95.3%,且萌发速度快(Higuchi&Amaki,1989)。凤尾蕨(Pteriscretica)孢子培养在KP培养基上,其萌发时间、原叶体达到性成熟及孢子体开始产生的时间均早于在1/2MS培养基上。穗乌毛蕨(Blechnumspicant)配子体在MS液体培养基中生长最适(Fernándezetal.,1997b)。原叶体培养普遍采用半固化培养基,Douglas和Sheffield(1990)等采用液体培养基将原叶体进行悬浮培养获得更好的增殖效果(Miller,1968)。孢子体培养大多采用MS培养基。培养基中的无机盐浓度很重要,对于组培效率及试管苗的正常发育均有影响。Higuchi和Amaki(1989)报道1/4MS对肾蕨(Nephrolepiscordifolia)孢子体培养效果良好,而巢蕨(Aspleniumnidus)则以全量MS效果最佳。银粉背蕨(Aleuritoptrisargentea)也以MS培养基最适于孢子萌发和原叶体生长,萌发率高达53.3%(黄笛等,2009)。Loescher(1979)的试验也证明了MS培养基会对肾蕨属孢子体培养过程中器官发生产生抑制,而稀释MS培养基可以解除这种抑制。Dykeman和Cumming(1985)发现,1/2MS对荚果蕨(Matteuaciastruthiopteris)的增殖最佳,而3/4MS对单个芽的生长最有利。张开梅等(2008)发现,西南凤尾蕨(Pteriswallichiana)在1/2MS培养基中萌发率可达83.3%。徐艳等(2005)也指出,白玉凤尾蕨(Pteriscretica)在1/2MS培养基中萌发率可达82.3%。Thakur等(1998)发现将荚果蕨(Matteucciastruthiopteris)起源于假根分生组织的侧根作为外植体,在含2.0mg·L-14-PU,0.5mg·L-1TDZ的1/2MS培养基中能获得高速率的分生组织增殖。根原基在悬浮培养基中比在固体培养基快,假根的形成和再生物的生长在不含激素含0.4%琼脂和1.1%活性炭的1/4MS固体培养基中达到最佳(Thakuretal.,1998)。由于直接从原叶体得到孢子体这一途径的效率一般较低,Knauss(1976)发明了一种称之为不完全组织培养技术,将培养了2个月的原叶体与1/2MS液体培养基以1︰20比例于搅切器搅切成匀浆物加入固体MS培养基直接诱导孢子体形成,能大大增加其增殖率。Fernández等(1999)将几种的蕨类进行机械性粉碎并将匀浆物进行体外培养,从孢子培养到孢子体发育的时间在不同种类中各有不同:对于有较快的生活史和孢子产量大的种类,如弗吉尼亚狗脊蕨(Woodwardiavirginica)、Dryopterisaffinis,将配子体匀浆是一种很有效的繁殖方法,能在短时间内产生大量的孢子体,但是对于欧紫萁(O.regalis),将配子体进行匀浆则抑制其孢子体的形成。此外还研究了培养基成分对欧紫萁(O.regalis)和剑叶凤尾蕨(Pterisensiformis)配子体发育的作用,在这些种类中,当配子体培养于含水和0.7%琼脂的培养基能促进孢子体的形成,而加入蔗糖则抑制配子体的发育,还会导致坏死;不含蔗糖的1/2MS基本培养基有利于剑叶凤尾蕨(P.ensiformis)孢子体叶的伸长(Fernándezetal.,1999)。Fernández等(1993)对巢蕨(Aspleniumnidus)孢子体和配子体分别进行匀浆后测试其在含3%蔗糖的MS培养基中的再生能力,2个月后,配子体匀浆再生出配子体,而孢子体匀浆则既形成孢子体又产生无孢子生殖的配子体。3.2叶瞳蕨pterisensi电泳的生长诱导外植体对芽生长的影响在原叶体生长发育阶段加入细胞分裂素能促进原叶体发育和孢子体形成。将荚果蕨(Matteucciastruthiopteris)的茎尖培养在含10-5和10-6mol·L-1细胞分裂素的半固体MS培养基中能诱导大量芽的形成(Gray&Partrick,1986)。Fernández等(1997b)发现,在穗乌毛蕨(Blechnumspicant)的培养中,加入外源的GA3后孢子能萌发,但配子体的发育受到强烈抑制,连二维生长都不能达到。孢子体可在无激素培养基中直接发育,但有些特殊蕨类按一般方法只能得到原叶体而无法诱导得到孢子体,如荷叶铁线蕨(Adiantumreniformevar.sinense)需要在成熟原叶体上滴加1mg·mL-1ABA才能诱导形成孢子体(Loescher,1979)。在大叶黑桫椤孢子培养中,将原叶体转入加有0.1mg·L-1NAA、0.1mg·L-16-BA和0.7%活性炭的MS培养基可长出绿色球状体(greenglobularbodies,GGB),如果想得到大量繁殖材料,可在此培养基上继代培养,短期内可得到很大量绿色球状体,再将球状体诱导成孢子体(徐艳等,2004)。Fernández等(1996a,1996b)报道:将穗乌毛蕨(Blechnumspicant)和剑叶凤尾蕨(PterisensiformisL.)幼嫩孢子体的假根培养在只含6-BA(0.44~4.4μmol·L-1)或者还含NAA(0.053~0.53μmol·L-1)的MS培养基中,1个月后能在假根的表面和内部长出一些伸长中心。将这样的假根培养于不含生长调节剂的培养基中1个月使内部伸长组织进行分化再生为大量的孢子体。再将该孢子体培养于上面提到的伸长培养基内,可诱导其表面的伸长中心产生配子体。此外,加入NAA的MS培养基可促进穗乌毛蕨(Blechnumspicant)GGB的伸长,同时促进穗乌毛蕨(Blechnumspicant)和剑叶凤尾蕨(PterisensiformisL.)假根形成,以及剑叶凤尾蕨(PterisensiformisL.)愈伤组织的形成。这种通过穗乌毛蕨(Blechnumspicant)假根形成GGB从而产生大量孢子体的方式,是对该种进行大规模孢子体繁殖的有效途径。Bertrand等(1999)也报道将Polypodiumcambricum的假根、叶片、叶柄和幼嫩孢子体根尖作外植体培养于含6-BA或NAA或两者结合的培养基。GGB即使在不含调控因子的培养基中也能产生,加入BA后对于假根产生GGB十分有效。而根尖外植体表现出最低的器官形成能力。用BA预处理的匀浆叶片或假根进行培养是该种蕨类植物繁殖的最有效途径。在肾蕨属(Nephrolepis)植物根状茎尖培养中,诱导不定芽的发生无需外源激素,但NAA、KT可以促进芽的形成和增殖,而6-BA起抑制作用(Loescher,1979)。Beck和James(1983)对鱼尾蕨(Nephrolepisfalcateformafurcans)的激素需求作了详细的研究,确定了KT1~2mg·L-1+NAA0.01mg·L-1的组合有利于芽的增殖和丛生苗的形成。在荚果蕨(Matteucciastruthiopteris)根状茎培养中发现,KT1~2mg·L-1对芽生长增殖效果佳,而NAA从对芽的生长增殖无促进作用(Dykeman&Cumming,1985)。Harper(1976)在几种蕨类植物组培中也发现,最佳激素组合为KT和NAA,KT范围1~2mg·L-1,NAA0.1~10mg·L-1;根的发生可被2,4-D、NAA等促进,但并非必需,根的发生在基本培养基中即可完成。在革叶蕨(Rumohraadiantiformis)组培中也发现6-BA对芽形成和增殖的抑制作用(Chen&Read,1983),但6-BA可以促进蜈蚣草(Pterisvittata)、二歧鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)茎端叶片形成不定芽(Camlohetal.,1994)。此外,6-BA还可以改变组培苗的再生途径,Higuchi等(1987)发现6-BA强烈抑制肾蕨属完整试管苗的发生,但有利于GGB的形成和增殖,且通过GGB繁殖的速率比通过丛生芽阶段繁殖的效率更高。后来GGB组培繁殖途径在多种蕨类植物中应用,如鸟巢蕨(Camloh,1999)、鹿角蕨(黄韶玲和张洁莲,1993)、乌毛蕨(Fernándezetal.,1996a)、皱叶肾蕨(金建平和兰涛,1992)、凤尾蕨(Amaki&Higuchi,1992)等。Loescher(1979)认为,低水平的2,4-D可以诱导波士顿蕨(Nephrolepisexaltalacv.Bostoniensis)生根,高浓度则促进愈伤组织形成。Leffring和Soede(1982)指出在培养基中加入0.3~0.5mg·L-1IAA时,波士顿蕨试管苗诱导效果好。此外,2-ip、4-PU、TDZ、GA3、JA等也在荚果蕨(Matteucciastruthiopteris)、海金沙(Lygodiumjaponicum)等蕨类组培中应用,并取得较好的增殖效果(Thakuretal.,1998;Nakamura&Maeda,1995;Camloh,1999)。精子器的发生与赤霉素有关。Yamane等(1979)运用多光谱测定发现,GA9的甲酯可调控海金沙(Lygodiumjaponicum)生殖器官的形成。这种精子器形成调控系统在穗乌毛蕨(B.spicant)中也有报道:将含有成熟配子体的培养基提取物加入新培养基中进行孢子培养,孢子萌发后,它们能在配子体发育的任何阶段发育成精子器,经过分离纯化这种培养基提取物,获得了赤霉素。经过HPLC分析还发现了一种非极性化合物,其存在时抑制配子体生长,但促进精子器的形成,其缺乏时配子体增加,同时形成颈卵器(Fernández&Revilla,2003)。对于脆铁线蕨(Adiantumtenerum),0.1~10mg·L-1的GA3降低原叶体长度和宽度,但促进精子器形成,增加GA3到100mg·L-1则抑制孢子萌发(Kao&Yeh,2003)。Fernández等(1997b)等发现,穗乌毛蕨(B.spicant)精子器形成的活性部分受游离和非极性的赤霉素酯影响,IBA为5和50μmol·L-1,6-BA为50μmol·L-1抑制精子器形成。多轮芳香烃(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)对蕨类生长发育也具有影响。有些报道指出PAHs促进植物生长和形态建成。将多足蕨配子体培养在无菌且含PAHs的培养基内,PAHs剂量0.1~10.0mg·L-1,多足蕨配子体生长模式可以变化,并可以在细胞水平上观察到形态建成;PAHs剂量0.1~3.2mg·L-1能促进从一维结构到二维结构的形态形成。这种PAHs处理的植物,与未处理过的相比,低剂量(0.1~0.32mg·L-1)和高剂量(1.0~3.2mg·L-1)PAHs分别促进和抑制细胞增殖,而10.0mg·L-1为有毒剂量,会降低孢子萌发和孢子体数(Forrestaetal.,1989)。3.3蔗糖对愈伤组织形成的影响对于营养物质的需求取决于蕨类的品种。薄囊蕨类如巢蕨(Aspleniumnidus),穗乌毛蕨(Blechnumspicant),Dryopterisaffinis,剑叶凤尾蕨(Pterisensiformis)和弗吉尼亚狗脊蕨(Woodwardiavirginica),富营养元素的培养基,如全量MS培养基,能大大增加其干质量,但欧紫萁(Osmundaregalis)则在Knop培养基中生长更好;氨加入Knop培养基中抑制欧紫萁(Osmundaregalis)配子体的生长,但对于剑叶凤尾蕨(Pterisensiformis)和穗乌毛蕨(Blechnumspicant)配子体生长却是必需的;氨对于氮源异养种类如松叶蕨属(Psilotum)和阴地蕨属(Botrychium)的配子体生长来说是一种重要的氮源(Fernández&Revilla,2003)。蔗糖是体外培养中最广泛使用的碳源。培养基中蔗糖浓度对孢子萌发有很重要的影响,如:桫椤的孢子随着培养基中糖浓度的降低(0~2%),萌发所需时间缩短(程治英等,1991)。蔗糖对原叶体发育和孢子体形成有促进作用(刘保东和檀龙颜,2009),在大多数蕨类中,配子体干质量随蔗糖浓度的增加而增加。然而欧紫萁(Osmundaregalis)的配子体在缺乏蔗糖的培养基中也能生长,说明存在植株的自养作用(Fernández&Revilla,2003)。而且据Fernández等(1997b)报道,在同样的渗透压下加入蔗糖和甘露醇,分别抑制和促进穗乌毛蕨(Blechnumspicant)配子体的生长和发育。在将凤尾蕨(Pteriscretica)分离叶片进行愈伤组织诱导分化的试验中,把幼嫩孢子体的叶片培养在加入2%蔗糖、1.0mg·L-12,4-D的White培养基中能诱导愈伤组织形成;获得的愈伤组织可以在含蔗糖和高浓度生长素的培养基中继续培养。当加入0.1g·L-1或更高浓度的蔗糖、葡萄糖或果糖时,愈伤组织形成孢子体,配子体形成也有发现;而不提供外源糖时,没有孢子体形成,愈伤组织只分化成配子体,而且这种作用不受0.01mg·L-12,4-D的影响(Bristow,1962)。Harper(1976)指出,MS培养基中添加P元素,称为MFMM培养基,广泛用于蕨类尤其是肾蕨属的组织培养中。Paek等(1984)也证明,MS+NaH2PO4200mg·L-1有利于肾蕨丛生苗的发生。Borgen和Nass(1987)认为培养基中添加磷酸钠盐有助于波士顿蕨的增殖。3.4配子体的生长和光反应绝大多数蕨类的孢子需要暴露于光下才能萌发和生长(吴华等,2010),但某些种类,如:阴地蕨属(Botrychium)和瓶儿小草属(Ophioglossum),则需要在黑暗中萌发(Fernández&Revilla,2003)。光还控制配子体的发育,光照是大多数蕨类配子体二维生长必需的(张银丽等,2009),但欧紫萁(Osmundaregalis)配子体却是在暗中出现二维生长和性器官的形成(Fernándezetal.,1997a),巢蕨(Aspleniumnidus)的配子体也是在较弱的光强下生长更好(Fernández&Revilla,2003)。当蜈蚣草(Pterisvittata)的孢子萌发后加入矿物盐并移到暗中直接由孢子发育为雄性孢子囊,这种雄性器官的发生受红光和蓝光抑制,这个光反应过程需要Ca2+和NO3-离子(Gemmrich,1986;Ito,1988)。Ito(1974)报道,将蜈蚣草(Pterisvittata)的单细胞原叶体置于连续红光下,就会持续在细胞分裂间期的G1期,如果在黑暗之后用蓝光照射能诱导细胞分裂;蓝光的作用能被之后的红光逆转,红光之后又要经过一个较长时间的蓝光才能诱导细胞分裂;在蓝光之后照射红光或移入黑暗中,细胞就从G1早期同步进入接下来的细胞周期而进入有丝分裂;在有丝分裂周期内无论是红光还是蓝光对诱导下一个细胞周期的进入都没有任何效果;因此可以通过1h的蓝光和15h的红光获得高同步性的细胞分裂。光利于苗的发生。Loescher(1979)等在肾蕨属植物组培中发现,光对不定芽的诱导是必需的,不能为外源激素和碳源替代。3.5温度对0.28.7的影响适宜蕨类孢子萌发和配子体生长发育的适宜温度为15~24℃,pH5.4~6.0(曾汉元和丁炳扬,2004)。肾蕨(Nephrolepiscordifolia)在27℃生长最好(Hvoslef-Eide,1991)。巢蕨(Aspleniumnidus)和穗乌毛蕨(Blechnumspicant)对pH4.2~8.7间变化有很大的耐受力(Fernándezetal.,1993,1997b)。欧紫萁(Osmundaregalis)在pH5.7时生长最适(Fernándezetal.,1997a)。Pangua等(1994)研究了铁角蕨属(Asplenium)3个种的孢子萌发和性器官发育对温度的要求;铁角蕨(A.trichomanes),厚叶铁脚蕨(A.scolopendrium)在10℃时所有孢子都能萌发,卵叶铁角蕨(A.ruta-muraria)在低于15~25℃时萌发延迟或受抑制。在10℃时,铁角蕨(A.trichomanes),厚叶铁脚蕨(A.scolopendrium)产生雌雄配子体和雌雄同体配子体,而卵叶铁角蕨(A.ruta-muraria)只产生雄配子体和雌雄同体配子体(Panguaetal.,1994)。4培养基的免疫作用蕨类植物除进行正常的世代交替过程外,在环境条件发生变化时,如营养不良、受损等情况下,能通过捷径来加速完成其生活史,即无配子生殖和无孢子生殖。孢子体由有性和无性配子体的分生组织发育而成或直接起源于原叶体细胞,不需经过授精过程,即孢子体属于无配子生殖(陆树刚,2007)。而无孢子生殖是孢子体直接衍生出配子体,经过配子融合形成多倍的孢子体。在自然条件下,世代转换发生的频率极低,而在组织培养条件下,可以大大促成配子体世代和孢子体世代的直接转换。在培养基中对世代转换调控起重要作用的是糖。一般认为高糖有利于无配子生殖,而低糖则促进无孢子生殖。Ambrožič-Dolinšek等(2002)对二歧鹿角蕨(Platyceriumbifurcatum)幼叶无孢子生殖产生的配子体进行诱导,将叶片外植体培养在含0、0.01%、0.1%、1%和2%蔗糖的MS培养基中发现,较低的蔗糖浓度(0.01%)和叶片近轴的伤口能促进无孢子繁殖产生配子体(90%的叶片产生配子体),细胞悬浮计数分析表明,孢子体和无孢子生殖产生的配子体的染色体倍数相同。MS培养基加入Difco-agar、糖醇(山梨糖醇、甘露醇)、生长调节剂(NAA、2,4-D、6-BA、细胞分裂素)和糖(果糖、葡萄糖、蔗糖),在低浓度时诱导蜈蚣草(Pterisvittata)叶片无孢子生殖,而在高浓度时同时产生无孢子配子体和愈伤组织,愈伤组织在没有生长调节剂的MS培养基中再生为孢子体,配子体在MS培养基中进行无性繁殖,但转移到1/10MS培养基中产生孢子体(Kwaetal.,1991)。糖在培养基中所起作用主要是营养而非渗透压作用(Hirsh,1975;Kwaetal.,1991),而糖醇是通过渗透压的调节对世代转换产生影响。低浓度糖醇有利于无孢子生殖的诱导(Kwaetal.,1991)。培养基中某些成分的变化,如将柠檬酸铁改为Fe-EDTA,有机N浓度的变化,高压灭菌与过滤灭菌对无配子生殖的诱发并无影响,而在原叶体培养中通过定期更换新鲜培养基,可以促进无配子生殖的发生(Whittier,1964)。在培养基中加入IAA可以诱发无配子生殖,而NAA、6-BA、2,4-D、KT在低浓度0.1~1mg·L-1时均有利于无孢子生殖的诱导(Kwaetal