营养期污染的产生原因及控制措施

营养期污染的产生原因及控制措施

污染是植物组织培养过程中的一个普遍问题。外植体材料、培养基、接种工具、接种室消毒不严格或无菌操作不规范及植物的内生菌的存在等因素均可导致污染的发生。培养物受到污染在组织培养中是经常遇到的,而且它还是一个很难控制的问题,若不能把污染率降低到可以接受的范围,那就意味着组织培养工作的中断,最后以失败告终,造成重大的经济损失。因此,分析污染的产生,进而控制污染成了植物组织培养中的重要工作。本研究以丽水职业技术学院组织培养中心月季快速繁殖过程中所出现的各种污染为取样对象,分析产生污染的原因,鉴定污染物中的微生物种类,确定污染的源头,进而有针对性地设计并落实一些控制措施,以期减轻或防止组织培养过程中污染的产生,同时也期望为植物组织培养工作控制污染的发生提供一定的理论和实践依据。1材料和方法1.111个月的集体培训过程1.1.1培养基的制备芽诱导培养基MS+BA0.8mg/L+NAA0.01mg/L;继代培养基MS+BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L;根诱导培养基1/2MS+NAA0.5mg/L。在以上培养基中加入蔗糖30g/L、琼脂6g/L,pH值调至5.8。1.1.2培训条件培养温度22~24℃;每天光照12h;光照度2000lx左右。1.1.3丛生芽的培养以健壮月季的带芽茎段为外植体,将其进行常规消毒后接种在芽诱导培养基上,经过14d的培养后,待腋芽伸长达1cm左右时,将其切下,进行继代培养。以后每隔28d将丛生芽继代培养1次。当所诱导的芽长到2~3cm时将其切下,转接到根诱导培养基上诱导生根,经过21d的培养,形成带根系的再生植株,最后进行移栽。1.2培养物的收集根据月季组织培养的不同培养时段,分阶段收集各种受到污染的培养物。收集时尽量多挑选形态各异的污染物为试验材料,共收集18份。按培养时段的不同,分为芽诱导培养时污染物11份,继代培养时5份,根诱导时收集到2份污染材料。1.3d左右的时间由于月季组织培养时间长,从初代培养到完成生根培养,最后移栽到温室,需45d左右的时间。而微生物的生长周期短、繁殖速度快,在组织培养过程中的温度、湿度、营养及培养基的pH等正是微生物生长的最佳条件,因此就会有众多的机会使培养瓶内的各种污染发生、发展,最后影响到培养物的正常生长。1.4纯分离和鉴定微生物菌落纯种的分离鉴定方法常用的有稀释法、平板划线分离法和单细胞挑取法等。本研究采用平板划线分离法进行操作。(1)平板培养基的制备在严格的无菌操作基础上,将经高温高压蒸气灭菌已冷却至约50℃的琼脂培养基(培养细菌用)、察氏培养基(培养霉菌用)、马铃薯葡萄糖培养基(培养真菌用)等分别倒入无菌的培养皿中,每个培养皿装量约为15mL,凝固后制成平板培养基。(2)种环挑取液表面形态将18个样品以较小的稀释度制成菌悬液,然后用无菌的接种环挑取1环菌液于平板上进行划线。操作时,左手持平板培养基,右手持接种环,左手食指将皿盖掀起一小缝,伸进带有菌液的接种环,在平板培养基上以交叉划线法进行划线。(3)培养抗菌剂将划线后的培养皿倒置于瓷盘中(以防冷凝水冲散菌体),放在28~30℃的恒温培养箱中培养1~3d后,待培养出菌落后,挑选单个菌落移入斜面培养。重复分离3次,得到纯种。最后,把分离所得的纯菌种进行载片培养,进而经显微镜检查鉴定。2结果2.1养基抗菌的特性通过对18份受污染的月季培养物的观察,发现在这些培养瓶内出现了不同症状、色彩和大小的微生物菌落。隔着培养瓶有的可清楚地看到培养基表面的黑色菌落,由开始的小黑点逐渐扩大,形成边缘不整齐的圆形,而其表面粗糙絮状,呈现出黑色疏松的粉状堆积;有的培养基表面有淡绿色的圆形菌落,也呈粗糙不平的松絮状,发展到后期会发黑形成孢子粉的堆积,打开瓶盖可闻到一股刺鼻的霉味;其他有的在茎段上长出白色的霉斑,或一些粉红色、灰黄色、淡黄色的菌落等。菌落除了在培养基的表面生长覆盖之外,还可沿培养基的裂缝、外植体或丛生芽基部向下扩展,严重的扩展到整个培养基。在其生长中分泌出各种次生代谢产物及色素使培养基被染色,呈现黄色、红色、粉红色。同时分泌毒素抑制或杀死外植体、丛生芽或组织培养苗。从以上的特征分析,污染的产生可归类为细菌污染与真菌污染。在月季组织培养中,经观察对照,发现在染菌后,腋芽生长受到了影响,丛生芽稀少,生长缓慢,并在芽尖上有发黄、枯、黑褐的现象,有烂叶发生;而在生根培养时杂菌的感染可使其不生根或生根短、根稀,甚至烂根,根的颜色发灰;绿叶黄化、枯萎、卷曲,最终导致整株死亡。2.2不同培养阶段常见的细菌、真菌种类及培养对象分析通过分离鉴定,在污染物中共获得细菌9个,真菌菌种26个,详见表1,2。从表1中可以看出,污染月季组织培养的9个细菌菌种中,肠杆菌属所占的比例最大,共4个,占细菌总数的44.5%;棒杆菌属次之,有2个,占22.2%,两者之和占了细菌总数的66.7%;而从表2真菌鉴定结果看,地霉属、曲霉属、毛霉属、根霉属的真菌个数达到23个,占真菌总数的88.5%。从各种菌类所处的培养阶段看,诱导培养阶段出现的细菌与真菌种类,有10属的34个种类;在生根阶段,出现的有7个属的30个种类,而表1,2中所列的所有细菌与真菌在增殖阶段都可以找到,这一切表明污染会发生在组织培养的每一个培养阶段。2.3污染发生的原因和控制措施2.3.1接种人员消毒处理不到位(1)接种室环境杂菌含量过高。(2)接种时,接种工具灭菌时间短,操作没有严格按照要求进行。(3)接种人员自身消毒不严。(4)外植体——带芽茎段消毒处理不完全。(5)继代、生根培养等阶段培养物的转接操作比较粗糙,将微生物带入培养瓶内,引起新的污染。2.3.2控制措施针对以上原因,对整个组织培养工作进行改进,采取了一些措施。(1)水擦试的消毒与灭菌用70%的酒精喷雾降尘消毒,用消毒水擦试地面、墙壁、工作台等;用紫外线照射消毒;用甲醛加少量的KMnO4熏蒸灭菌。仔细做好实验室的清洁卫生。(2)工作台超净工作台使用前打开工作台紫外灯,照射20min;操作前10min使超净工作台处于工作状态,让过滤空气吹拂工作台面和四周台壁,然后关闭紫外灯,用70%的酒精擦拭工作台面,以确保工作台处于无菌状态。(3)植体消毒灭菌不彻底在月季茎段快繁中,出现杂菌污染了整个茎段的现象或仅在茎段的基部出现杂菌,这都是外植体消毒灭菌不彻底的后果。因此,在选择茎段进行组织培养时,可采用2次灭菌法,即将月季茎段用70%酒精浸泡30s,以0.1%升汞处理8min,无菌水冲洗5次后,再用2%的次氯酸钠液消毒10min,在无菌水冲洗3~5次后接种,效果较好。(4)接种器械的烧瓶口接种前双手用70%的酒精擦洗,接种时要用火焰烧瓶口,转动瓶子使瓶口各部分都能烧到;接种器械要反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灼烧灭菌;接种期间要经常用70%的酒精擦试工作台和双手。(5)组织培养材料的选择一旦发现培养瓶内有污染产生,应立即采取合适的方法进行处理。对感染杂菌的培养瓶应在专门处理室内将培养基、组织培养苗或外植体等连瓶一起(不能打开瓶盖),先进行高压蒸气灭菌,然后再进行清洗处理;未处理前不能将它们转接到其他培养基中增殖培养,不能随意弃置,以防扩大污染和在周围环境中的传播。组织培养中的植物材料选取受到一定的限制,因此要注意节约使用。在组织培养苗受污染后,若污染的程度不是很重,则有必要进行再处理,消灭污染的杂菌,使植物材料能再次利用,减轻组织培养中取材困难的问题。许婉芳等在抑菌剂对金线连组织培养中微生物污染的抑制实验中,发现50%的多菌灵效果优于70%甲基托布津和25%的甲霜灵,其抑菌率100%,且能促进金线连的生长;李颖等将已被杂菌污染的银白杨、四倍体刺槐、微型月季和地被菊等4种组织培养苗,采用多菌灵和青霉素混合液浸泡处理,发现多菌灵能有效杀灭真菌,对细菌没有明显作用,而青霉素在初代培养时起抑制细菌的作用,然继代后细菌污染照常存在,因此在初代培养时可把两者混合使用,对培养过程污染的产生有明显的抑制作用。本研究中,月季组织培养材料来自于带芽茎段,采取数量有限,因此在实验中借鉴李颖等的做法,将受污染的月季茎段或丛生芽取出,置于多菌灵3g和青霉素40万单位的100mL混合液中,浸泡3min后,用无菌水冲洗3遍接种培养。连续观察15d,月季的芽生长势良好,未发生污染,结果与李颖等研究一致。3组织培养污染的原因(1)在18瓶污染物中分离鉴定出细菌5个属9种,真菌6个属26种;其中的肠杆菌属、棒杆菌属细菌占细菌总数的66.7%;地霉属、曲霉属、毛霉属、根霉属的真菌占真菌总数的88.5%,它们是月季组织培养过程中引起污染的主要微生物菌类,因此是月季组织培养过程污染防止的重点对象。(2)从各种菌类所处的培养阶段看,出现的细菌与真菌种类以增殖阶段时数量与种类最多,诱导培养阶段次之,在生根阶段较少,但也不乏有7个属的30个种类的细菌与真菌出现,表明污染在组织培养的每个培养阶段中都会发生。(3)从组织培养过程产生污染的培养瓶数量来看,在诱导培养阶段污染的量较大,这与外植体消毒不彻底有很大关系,另外无菌意识不强、无菌操作技术不熟练也是一个重要因素;在继代培养与生根培养时,污染率明显下降,但也出现了在转接培养物时,环境中的杂菌带入培养瓶内,造成新污染的现象,因此注重无菌操作的训练,提高操作水平是降低污染率的重要手段。(4)控制或降低污染率是植物组织培养的关键技术,同时也是组织培养工作效率高低的重要指标之一。为了实现低污染率,在组织培养中除了采用常规的技术措施之外,还在培养基中有针对性地加入抑菌剂(如抗菌素)。韩美丽等在绿巨人组织培养中研究了青霉素钠、先锋霉素和庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果,指出先锋霉素抑菌最好,青霉素和庆大霉素次之;翟建中等研究发现链霉素能防除长春蔓芽继代培养中出现的细菌。但有报道在多数情况下使用抗菌素只能抑制细菌的生长而不能杀死它,浓度太高对植物有一定毒害作用,而且抗菌素一般不稳定、遇酸碱或加热易分解而失去活性,这些问题的存在使得抗菌素的使用受到一些限制。因此,寻找理想的抗菌素成为控制污染的一个重要课题。本研究在月季的芽诱导培养过程中将受污染程度较