基于原球茎诱导和培养基选择的西兰花组织培养研究进展

基于原球茎诱导和培养基选择的西兰花组织培养研究进展

兰花是兰科植物的总称。兰科植物是开花植物中最大的家族之一,而且是单子叶植物中最高度演化的一科,有6个亚科725属25000余种,广泛分布于全球各地。兰花在中国约有170个属1200余种,分布较为广泛,几乎全国各省都有。其中,青藏高原就有99属474种及9个变种,广东有71属208种。兰花不仅具有极高的观赏价值,还具有独特的食用和药用价值。兰花的根、叶、花、果、种子均有很高的药用价值。印度人曾经用兰花EriopsisLindley治疗唇疮,同时其还可以舒缓牙龈和口腔黏膜的不适。不仅如此,兰花对于现代社会人类高发病症——癌症也有较好的功效。因此,兰花的组织培养及快速繁殖技术的发展以及基因功能的研究对促进人类的健康及医疗事业都有着重要的意义。1兰组培养的研究1.1褐化、叶片和种子外植体的选择直接关系到原球茎的诱导。在组织培养中幼嫩部位产生褐化较轻,所以一般选取较幼嫩且生长旺盛的部位。茎尖、叶片和种子是诱导原球茎的理想外植体来源。花瓣、萼片、子房、休眠芽、侧芽、花梗节间段、根尖等均可作为外植体诱导出原球茎。1.1.1用单茎性兰作为外植体的诱导茎尖是最早也是使用频率最高的兰花外植体,侧芽应用也相当广泛。茎尖和侧芽顶端分生区细胞的分裂能力强,容易诱导出原球茎。大花蕙兰(Cymbidium)、卡特丽亚兰(Cattleya)、石斛兰(Dendrobium)、墨兰和建兰等均成功用茎尖诱导出大量的原球茎。但对一些单茎性兰花,如利蝴蝶兰(Phalaeanopsis)、仙指甲兰(Aerides)等用茎尖作为外植体有可能丧失母株,因此需要寻找其他外植体。经过对茎尖及侧芽的取材时间、部位及大小的研究,一般认为带1~2个叶原基的茎圆锥成活率高,中间部位侧芽成活率也较高。1.1.2叶片诱导物叶片作为外植体既可减少对母株的伤害,取材又不受季节的限制,且数量多,是比较理想的外植体材料来源。但实验也表明虽然叶片也具有诱导出原球茎的能力,但成熟叶诱导出原球茎的能力极弱。幼叶诱导出原球茎的能力较成熟叶强,但诱导率也很低,对于大花蕙兰仅为3.3%左右。1.1.3非共生萌发法在自然条件下兰花种子虽多,但由于其不具有发育完全的胚,且种皮致密、透性差或种皮中含有抑制物使种子很难萌发。自NoelBernared在1899年创立了兰花种子共生萌发法后,研究者们接着发现大部分兰花种子也可以通过无菌萌发的方式进行,即非共生萌发。兰花种子的非共生萌发已在蝴蝶兰、石斛兰、文心兰等兰花中取得成功。2005年中国科学院昆明研究所首次利用种子成功的诱导出云南野生拖鞋兰和独蒜兰。由于种皮致密等原因,对部分兰花种子的预处理也有利于兰花种子的萌发。田梅生等用剪刀将四季兰种皮剪破后种子的萌发率大大提高。1.1.4对含成类原球茎的植物诱导研究者们一般很少用花梗节间段作为外植体。鲁雪华、郭文杰等在2002年成功地用蝴蝶兰的花梗节间段诱导出原球茎,并且通过实验表明花梗节间段形成类原球茎的频率明显高于其它外植体(茎尖、根尖)。苏加乐等也成功利用蝴蝶兰的花梗节间段高效诱导出原球茎和增殖。1.1.5不同花兰组织培养Stewart等用树兰(Epidendrum)的根首次成功地培养出了原球茎和从愈伤组织分化出1株苗。后来,根的诱导相继在不同兰花中获得了成功。徐宏英等用大花蕙兰的幼根成功地进行组织培养,来检测其快速繁殖的影响因素。但由于兰花的根部是共生菌根,所以根部作为外植体较难灭菌,在组织培养的过程中较容易污染。1.2基础研究和添加材料1.2.1培养基的营养成分兰花的组织培养中常用的培养基为MS、VW、KnudsonC、Kyoto、White和它们的改良型,应根据不同品种而选择合适的培养基。如对于大花蕙兰,MS,1/2MS,VW,KC均可应用于原球茎的增殖,但以KC效果最好。MS培养基营养成分含量丰富,有利于增殖,不利于分化。White培养基的营养成分含量低,有利于分化。本实验小组正在选取不同的培养基对春兰和惠兰进行组织培养并取得一定进展。蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂,不同浓度对兰花原球茎的生长、分化影响较大。2%的蔗糖最有利于原球茎的生长,2%~3%的蔗糖促进芽的形成,而根的分化和生长则以5%的蔗糖最适合。无机盐用量也不尽相同,如春兰要求培养基中的无机盐量要少,墨兰要求的量较大。培养基中使用的外源激素主要是生长素类(如IAA、2,4-D和NAA)和细胞分裂素类(如BA、ZT和KT)。不同的兰花、不同的生长发育阶段所需激素的量和种类也不尽相同。1.2.2附加香蕉泥对原球茎增殖的影响适量的提取物,如在培养基中添加番茄汁、蛋白胨、酵母提取液、水解蛋白、苹果汁、香蕉汁等可促进兰花种子的萌发。附加香蕉泥对原球茎的增殖有明显的促进作用。香蕉匀浆物在KC培养基和White培养基是最适合原球茎增殖的添加物。水解酪蛋白对于原球茎的增殖有明显的促进作用。另外,胰蛋白胨、酵母提取物和KC培养基一起使用对原球茎的增殖有促进作用,但酵母提取物在White培养基上使用,对原球茎的增殖却有抑制作用。1.3花的育种研究中国兰花种质资源非常丰富,但其主要是地生兰中的小花品种,所以与引进的洋兰相比其市场占有量很小。目前对兰花的研究主要集中在组织培养快速繁殖方面的研究,但兰花人工育种方面的研究相对来说很少。四川农科院的吴汉珠等进行国兰品种间的杂交研究获得的优良品种有十余个在中国兰花博览会上获得金奖,这些优良品种具有很好的市场。因此兰花的杂交育种的广泛研究与组织培养快速繁殖研究相结合必定会给中国兰花产业带来广阔的市场与经济价值。2兰酶的科学研究2.1聚类分析结果应用RAPD等分子标记技术检测兰属品种间的亲缘关系是近些年来兰花分子系统学研究的重要手段,如梁红建等用RAPD分析技术对19个中国兰花进行品种鉴定和分类研究。随机引物扩增条带显示每个兰花品种都有其特有的扩增带可与其它品种区别。这种特异的条带可作为一个品种的分子标记而应用于品种鉴定。RAPD对基因组的分析结果与传统分类学的结果基本相符。李文等从55种10个碱基的随机引物中筛选出4种引物,扩增出93条多态性带分析兰属的亲缘关系。通过聚类分析表明,建兰、墨兰、春兰的亲缘关系较近,而春剑、寒兰、独占春和兔耳兰与建兰的亲缘关系较远。Cafasso等人利用位于叶绿体tRNALEU内含子的微卫星重复序列分析发现兰花Anacamptispalustris的叶绿体是母本遗传,为研究其亲缘关系提供分子依据。兰花染色体数目和大小变化的物种多样性的形成与众多因素有关。Cozzolino等认为兰花欺骗性的传粉是其花和物种多样性形成的一个关键因素。Otero等人注意到兰花菌根间的相互作用对兰花生物多样性的影响是个不可忽略的因素。Moccia等利用核糖体ITS(internaltranscribedspacer)和AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)研究自然杂交和杂交频率并结合传统的方法(野外观察等)发现传粉者依赖的生殖隔离对食物欺骗性的兰花发挥很小的作用。这个研究通过应用和结合新旧生态学和遗传学的研究方法为兰花生物多样性的研究开辟了新思路。2.2基因功能研究2.2.1兰花的mads-前体基因家族含有MADS-box结构域的植物转录调节子参与植物的再生和生长变化过程。根据形态学和遗传学分析发现花的四个结构是由三个调节基因家族(ABC)来控制其发展变化的。研究拟南芥的B和C功能基因发现它们控制花瓣、雄蕊和心皮的发生,在结构上是含有高度相似的MADS-box结构域的基因。所有的B功能基因都属于MADS-box结构基因家族。这些B功能基因又可归纳为DEF/AP3-和GLO/PI-like两组紧密相关的MADS-box结构基因家族。兰花是单子叶植物中高度演化的一科,与双子叶植物不同的是所有兰花都具有色的萼片。因为兰花的萼片和花瓣具有相似的颜色和形状,所以被统称为花被片。兰花的柱头和雄蕊也形成一个高度特化的合蕊柱结构。兰花的这种复杂的花结构及其发育过程和许多单子叶还有双子叶植物一样都受到MADS-box基因的功能调节。对兰花的MADS-box结构基因家族进行研究,HSU等人发现金蝶兰属(Oncidium)OMADS3(AP3-like基因)调节兰花的形成和发育。Tsa等人研究蝶兰(Phalaenopsisequestris)发现PeMADS6(GLO/PI-likeMADS-box基因)与兰花的花瓣形成和与花期的寿命还有子房的发育有关。BinGuo等人通过克隆鉴定及功能研究兰花Phalaenopsis的一个PI-likecDNA发现其是决定兰花花型的B族MADS-box基因PhPI15。转基因烟草异常表达PhPI15出现雄性不育表型。不同的生物化学和分子事件如改变DNA甲基化的样式、激活转座因子或者染色体改造都能使高等植物的体细胞发生突变。兰花的杂种再生植株的体细胞突变已有报道。Chen等人根据表达序列标签EST应用cDNA-RAPD和cDNA抑制差减杂交(SSH)分析出野生型和奇花突变株蝶兰的杂种基因表达差异。应用RT-PCR检测发现bZIP转录因子、DNA甲基化酶和组蛋白乙酰转移酶的表达在突变体被下调,而植物生长激素调节蛋白激酶、TCP相关基因的表达被上调。SSH分析发现与花型对称相关的TCP家族蛋白D20在突变体中被检测到,这为更好地研究其在蝶兰的花型改变发挥的生物学功能提供条件。2.2.2病毒诱导的基因沉默技术研究非模式生物的功能基因组去揭示调节网络的改变对多样性的影响在生物界一直是个很大的挑战。研究非模式生物的困难在于巨大的基因组、很低的转化效率、很长的再生时间和生活周期,这些因素都导致非模式生物的功能基因组研究的进展缓慢。兰花的特殊传粉和生态策略的多样性为研究进化关系和发生生物学提供了丰富的课题。但是大多兰花基因组巨大而且生长周期长使得传统的分子和遗传学方法都不利于其功能基因组的研究。最近发展的病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)被广泛应用于植物功能基因组的研究。Lu等人根据MADS-box基因的EST序列,利用兰花花叶病毒构建质粒研究含有MADS-box结构域的基因功能。将兰花的MADS-box基因PeMADS6一段独特的核苷酸序列(150bp)插入到pCymMV-pro60,结果PeMADS6在被嫁接的蝶兰(Phalaenopsis)的表达被显著抑制,但其他的MADS-box基因家族基因的表达变化没有被察觉。而插入保守的500bp时,PeMADS6和MADS-box基因家族的其他成员表达也都显著的被抑制。在这些MADS-box基因被沉默的兰花植株,其花的形态也发生了明显的变化。原本需要一两年才能检测到的RNA变化用病毒诱导基因沉默的方法两个月就能检测到。VIGS技术的应用对兰花功能基因组的研究必定具有很大的推动作用,也为其他用传统分子和遗传学方法不能研究的非模式植物功能基因组研究提供帮助。2.2.3大花推动细胞基因突变研究兰花的转基因研究近年来也发展迅速。陈文辉等利用农杆菌对蝴蝶兰原球茎进行了基因转化研究,以NPTⅡ和GUS基因作标记,初步建立了蝴蝶兰的农杆菌转基因体系。Yang等将带有NPTⅡ标记基因的pKH200质粒,通过基因枪对大花蕙兰原球茎进行了转基因研究,获得了抗卡那霉素的转基因植株,通过PCR分析,验证NPTⅡ基因存在于转基因植株中。近两年来基因叠加(genestacking)的转基因农作物的研究和应用迅速发展,Chan等人首次将兰花花叶病毒的衣壳蛋白cDNA(CP)和甜椒的类铁氧还蛋白cDNA(Pflp)在Agrobacteriumtumefaciens的辅助作用下对兰花原球茎进行基因双重转化,成功筛选