阴道念珠菌感染致病菌种及抗真菌药物耐药谱研究

阴道念珠菌感染致病菌种及抗真菌药物耐药谱研究

细菌是人体的常见寄生虫。如果身体的免疫能力降低，可能会导致各种机会性感染，这通常是一些严重患者的直接原因。本文以妇产科常见病———念珠菌阴道炎（VVC）的致病原为研究对象，从临床分离培养鉴定菌株589株，对其菌种分类、药敏结果进行分析，并结合耐药基因分型研究，从临床、细胞、分子三个水平探讨念珠菌的致病与耐药现象以及流行病学特征，希望不仅能对念珠菌阴道炎的治疗有帮助，而且能对机体其它部位念珠菌病的临床治疗提供借鉴。1数据和方法1.1病例选择及用药史收集2002年6月～2003年2月在本院门诊就诊的VVC患者589例，年龄19～51岁，均为再发病例，即本次发病时间距前次患病达3个月以上，定义为再发患者。详细询问患者既往患VVC时间及用药史，患者病程3月～20年，平均2.5年。其中用过唑类药者551例（93.6%）。取患者的阴道分泌物，镜下找到孢子或菌丝，分离念珠菌作进一步鉴定。1.2细菌的分离和鉴定将标本接种于沙氏培养基，37℃孵育24～48h，分纯后用VITEK32的酵母菌鉴定卡（YBC）鉴定菌种。1.3药物过敏试验5-氟胞嘧啶、两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、酮康唑的敏感性测试采用ATBFUNGUS试剂盒，按照说明书操作。1.4通过机械pcr方法确定白色念菌的基因型1.4.1提取的细菌dna1.4.2gtagcgk-raERIC引物ERICΙ(CAT-GTAAGCTCCTGGGGATTCAC)、ERICⅡ(AAGTA-AGTGACTGGGGTGGAGCG)，由上海生工合成。50μl反应体系中含5mMMgCl2、0.2mMdNTP、2.5uTaq酶、2μl模板（0.05～2μg）、ERICΙ2μM、ERICⅡ2μM。扩增条件：94°C预变性5min;94°C40s,40°C1min,72°C1min循环35次。每菌株用两种模板浓度及两个以上的PCR反应以证实ERIC-PCR的可重复性。1.4.3bio-rad透射检测将临床白色念珠菌ERIC-PCR扩增产物各取10μl加样于2%琼脂糖凝胶，在80V恒压下电泳1h，溴乙锭染色。用BIO-RAD透射式紫外分析仪分析结果。白色念珠菌标准菌ATCC90028及近平滑念珠菌标准菌ATCC22019基因型分析作对照。1.4.4具有白净菌酶活性物质的敏感植物与抗炎菌群落的ri-pcr基因型之间的比较将147株白色念珠菌咪康唑敏感株及60株耐药株同法行ERIC-PCR扩增，比较两组基因型种类。1.5统计处理2结果2.1种鉴定结果585例的阴道分泌物分离出念珠菌589株，其中4例分离出2种念珠菌。经菌种鉴定共有6种菌株，其中白色念珠菌487株，占总数82.7%；光滑念珠菌75株，占12.7%；热带念珠菌18株，占3.0%；近平滑念珠菌7株，占1.2%；克柔念珠菌及郎可比念珠菌各有1株，各占0.2%。药敏试验结果见表1。2.2对酮康唑、咪康唑和益康唑的耐药率两组的耐药谱显著不同，从表1可见，与白色念珠菌相比，非白色念珠菌对酮康唑、咪康唑与益康唑的耐药率高（P<0.01）；白色念珠菌则对5-氟胞嘧啶较多耐药(P<0.01)。2.3酮康唑耐药情况念珠菌对唑类存在明显交叉耐药现象，72株益康唑耐药的念珠菌中有68株（94.9%）同时对酮康唑耐药，69株（95.80%）对咪康唑耐药；80株酮康唑耐药的念珠菌中，79株（98.26%）对益康唑耐药，77株（96.52%）对咪康唑耐药；79株咪康唑耐药的念珠菌中有69株（87.69%）对益康唑耐药，67株（85.38%）对酮康唑耐药。2.4不同菌株的认证指纹和细胞条带琼脂糖电泳凝胶分析显示，ERIC-PCR指纹具有良好的稳定性，同一菌株一定扩增条件下不同模板浓度的扩增带型一致；近平滑念珠菌ATCC22019的ERIC-PCR指纹与白色念珠菌标准菌ATCC90028及其它白色念珠菌实验菌有明显差异；白色念珠菌菌株间有一些共同的特征性条带，如300～400bp间的二联带及100bp、150bp处的条带；但白色念珠菌菌种内不同菌株间仍存在差异条带;在147株白色念珠菌咪康唑敏感菌株与60株咪康唑耐药菌株的ERIC-PCR指纹比较中发现，两组基因型种类一致，未发现咪康唑耐药株特征性带谱。3菌株分子特征的新探讨随着抗真菌药物在临床的广泛应用，致病菌谱改变的报道也日渐增多。1990年以来，各类调查发现非白色念珠菌感染有上升趋势，国外资料报道VVC中白色念珠菌占85%～90%，而光滑念珠菌占5%～10%，热带念珠菌占5%。本研究对再发性VVC患者致病菌种统计表明，所检出的念珠菌仍以白色念珠菌为主，达82.7%，而非白色念珠菌中则以光滑念珠菌占多数，达12.7%。在再发病例中光滑念珠菌感染的比例较高,提示光滑念珠菌引起的阴道炎可能较为难治，其原因可能与光滑念珠菌对最常用抗真菌药唑类的内在耐药性较高有关。因而临床对再发性VVC患者应注意鉴定致病菌种，给予针对性的治疗。在我们的统计中还发现，念珠菌对益康唑、酮康唑、咪康唑三种唑类药物有很高的交叉耐药性。这说明在临床抗真菌治疗中，若对上述三种唑类药物之一存在耐药，不宜再用另两种药物。5-氟胞嘧啶大多用于治疗深部真菌感染，极少用于VVC病例，在本研究中发现白色念珠菌对5-氟胞嘧啶耐药率高达38.1%，说明白色念珠菌对5-氟胞嘧啶的原发性耐药率较高，在深部感染治疗时应注意配伍使用其它药物。两性霉素B也主要用于深部真菌感染治疗，本统计中两性霉素B耐药率低，这与文献报道一致。制霉菌素的应用应引起重视，该药物属于多烯类抗生素，广谱抗真菌机理同两性霉素B，从本文结果看念珠菌极少对制霉菌素耐药，似乎更应受到临床青睐。念珠菌耐药株与敏感株之间内在的分子基础的联系一直受到关注。本研究采用ERIC-PCR基因分型方法以最常见的白色念珠菌咪康唑耐药株、敏感株为对象在基因组水平对此作了探讨。所采用的ERIC引物序列是许多细菌基因组中的共有序列，真菌基因组中并不存在，ERIC-PCR因而实质上是一种随机扩增PCR(RAPD-PCR)。Taksuka等比较了从艾滋病人口腔中分离的氟康唑耐药株的形态、核型及DNA分型，发现ERIC-PCR能够区分种以下的分离株，其区别水准相当于脉冲场凝胶电泳。本试验用这种方法对白色念珠菌进行基因型分析，发现白色念珠菌菌株间有一些共同的特征性条带，但不同菌株之间仍有差异，证实了ERIC-PCR基因分型方法具有区分种内亚株的敏感性，提示在临床实践中有可能作为菌株分型分株的方法之一。关于耐药株与敏感株相比无特征性的DNA指纹改变，其他研究者也有类似结论，其原因可能是由于白色念珠菌对唑类的耐药主要是继发性的，部分耐药发生是由于基因的表达差异；这也从另一角度说明了基因型的相对稳定性及其在流行病学调查中的价值。ERIC-PCR基因分型方法虽不能作为耐药诊断的依据，但因其能区分种内亚株而有助于鉴定临床耐药菌株的敏感亲本