常用分子生物学技术的原理及应用课件

常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique常用分子生物学技术的原理及应用

一、基本概念核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)：不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。常用分子生物学技术的原理及应用复性RNADNA常用分子生物学技术的原理及应用探针：是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用以检测核酸样品中存在的特定基因。常用分子生物学技术的原理及应用印迹技术(BlottingTechnique)：

将生物大分子物质，核酸或蛋白质进行凝胶电泳分离成若干条带后，转移（印迹）到固化介质（常用NC膜、尼龙膜）上，再与探针进行杂交的反应。常用分子生物学技术的原理及应用二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlot)（二）RNA印迹(NorthernBlot)（三）蛋白质的印迹

(WesternBlot)用于基因组特异基因的定位及检测，重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性分析.比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况。用于蛋白质定性,半定量及蛋白质相互作用研究。常用分子生物学技术的原理及应用其他：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA芯片技术(DNAchip)常用分子生物学技术的原理及应用（一）DNA印迹(SouthernBlot)1、概念：将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上，再通过特异性探针的杂交检测被转移的DNA片段的一种方法。这是由E.Southern于1975年首先设计应用的，因而以其姓氏命名。常用分子生物学技术的原理及应用2、基本过程：（1）酶切：用限制性内切酶消化DNA样品（2）电泳：通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段按小分离（3）变性：将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性（4）转移：使胶中的DNA分子转移到固相支持物（NC膜或尼龙膜）上（5）固定：在80℃真空条件下加热或在紫外交联仪内处理使DNA固定于膜上（6）杂交常用分子生物学技术的原理及应用分子杂交实验①②③常用分子生物学技术的原理及应用3、应用：用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。常用分子生物学技术的原理及应用（二）RNA印迹(NorthernBlot)：1、利用与DNA印迹相类似的技术分析RNA就称为RNAblot。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northernblot。常用分子生物学技术的原理及应用2、基本过程：

与SouthernBlot相似，但有以下不同：RNA分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割变性RNA的转移效率比较高常用分子生物学技术的原理及应用3、应用：（1）检测某一组织或细胞中已知的特异

mRNA的表达水平（2）比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况常用分子生物学技术的原理及应用（三）蛋白质印迹(WesternBlot)

1、概念：蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于DNA的SouthernBlot和RNA的SouthernBlot，蛋白质印迹被称为WesternBlot。常用分子生物学技术的原理及应用2、基本过程：(1)电泳（Electrophoresis）：一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。

常用分子生物学技术的原理及应用

蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。目前进行的Western印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。

(2)转膜(Transfer)：常用分子生物学技术的原理及应用(3)封闭(Blocking)：

封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用Westem印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。常用分子生物学技术的原理及应用(4)一抗孵育(Primaryantibodyincubation)：

特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合.常用分子生物学技术的原理及应用(5)二抗孵育

(Secondaryantibodyincubation)：

碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或放射性核素标记的二抗与之反应。二抗需根据一抗进行选择。常用分子生物学技术的原理及应用(6)显色：

用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度.常用分子生物学技术的原理及应用放射自显影照片常用分子生物学技术的原理及应用3、应用：（1）检测样品中特异蛋白质的存在（2）细胞中特异蛋白质的半定量分析（3）蛋白质分子的相互作用研究常用分子生物学技术的原理及应用三种印迹技术的比较常用分子生物学技术的原理及应用第二节

PCR技术的原理与应用常用分子生物学技术的原理及应用聚合酶链反应

(PolymeraseChainReaction,PCR)，

体外核酸扩增技术。

能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。

PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。常用分子生物学技术的原理及应用PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。常用分子生物学技术的原理及应用KaryB.Mullis（1944－）http://常用分子生物学技术的原理及应用“Idomybestthinkingwhiledriving”1993Nobelprize

常用分子生物学技术的原理及应用一、概念：PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链反应:

在体外对目的DNA进行大量扩增的技术，当目的DNA加热变性时，使其成为单链，与一对特异性引物在退火时进行杂交，在耐热的DNA聚合酶作用下进行反应，并循环进行几十次，使目的DNA得到大量的扩增。(其基本理论建立在DNA变性、复性及分子杂交的基础之上。)常用分子生物学技术的原理及应用PCR技术的特点

1.高度的敏感性

单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在一百万倍以上，即可将极微量(pg级)DNA，扩增到紫外光下可见的水平(μg级)。它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。常用分子生物学技术的原理及应用2.高度的特异性

PCR扩增的特异性依赖于两个引物设计的特异性，依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性也有影响.

在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR扩增的特异性是相当高的。

常用分子生物学技术的原理及应用

3.操作简便、快速

PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

4.适用样品的广泛性

既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。常用分子生物学技术的原理及应用

二、PCR的基本原理1、PCR反应体系模板DNA

特异引物底物dNTP

耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）

Mg2+缓冲液常用分子生物学技术的原理及应用threesteps:HowPCRworksDenaturation

(变性):90～97℃Annealing

(退火):45～55℃Extension

(延伸):

around72℃常用分子生物学技术的原理及应用2、基本反应步骤：变性（denature）：将反应体系加热至90-97℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。常用分子生物学技术的原理及应用TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep1:Denaturation

变性94℃

常用分子生物学技术的原理及应用退火（annealing）：当温度突然降低至45-65℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。常用分子生物学技术的原理及应用TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep2:Annealing

退火T

℃

primer-dependent

CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAG常用分子生物学技术的原理及应用延伸(extension):将温度升高至70-74℃下，在TaqDNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。常用分子生物学技术的原理及应用TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep3:Extension

延伸72℃CGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaqPolymeraseTaqPolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATCGCGATATTACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA常用分子生物学技术的原理及应用

以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30）次即可达到扩增DNA片段的目的。常用分子生物学技术的原理及应用聚合酶链式反应1.Denaturation2.Annealing3.ExtensionPCR.EXE常用分子生物学技术的原理及应用5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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常用分子生物学技术的原理及应用Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。常用分子生物学技术的原理及应用5

EssentialComponentsofPCRReaction

salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNA常用分子生物学技术的原理及应用（一）DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。比如：TaqDNA聚合酶。Taq:Thermusaquaticus95℃,T1/2(halflife)40minTaqDNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性二）镁离子浓度Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。一般常用1.5mmol/L三、PCR反应条件的优化常用分子生物学技术的原理及应用Polymerization

聚合反应Taq

PolymerasedTdAdGdCdT5’3’3’5’ATaq

polymerase:

72℃,2,000～4,000bases/min常用分子生物学技术的原理及应用（二）PCR引物1.长度：15～30个核苷酸2.碱基随机分布，G+C：45％－55%

两端引物有近似的Tm值3.引物内、引物间不应有互补序列4.引物与非特异扩增区无同源性5.3′端必须互补5′端可游离十几个碱基，而不影响反应，可修饰(引物浓度一般为0.1～0.5mol/L)常用分子生物学技术的原理及应用（三）PCR反应缓冲液：组成50mMKCl10mMTris.Cl(pH8.4)1.5mMMgCl2Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。Mg++浓度的高低能影响反应的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mMMg++是比较合适的。Mg++过量能增加非特异性扩增并影响产率。（四）底物dNTP浓度在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM,dNTP浓度过高可加快反应速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于dNTP可能与Mg++结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。常用分子生物学技术的原理及应用四、PCR技术的主要用途

（一）目的基因的克隆可以利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段常用分子生物学技术的原理及应用（二）基因突变

利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。常用分子生物学技术的原理及应用（三）DNA和RNA的微量分析

PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

常用分子生物学技术的原理及应用（四）DNA序列测定将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。常用分子生物学技术的原理及应用（五）基因突变分析

PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。常用分子生物学技术的原理及应用四、几种重要的PCR衍生技术（一）逆转录PCR技术反转录PCR（reversetranscriptionRT-PCR）：以RNA为起始模板产生cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。常用分子生物学技术的原理及应用逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

cDNAcomplementaryDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增常用分子生物学技术的原理及应用RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。

常用分子生物学技术的原理及应用（二）原位PCR技术

原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是