微生物学课件：第2章 纯培养和显微技术

第2章纯培养和显微技术ContentBasiclaboratorytechniquesforcultivationofmicrobiologyBasiclaboratorytechniquesformicroscopicexamination微生物的基本特点：小！

在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；

微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术在微生物学中具有重要意义！参见P13在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！参见P13

微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。（P12第一段）微生物的基本特点：小！参见P13第一节微生物的分离和纯培养无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法第二节显微镜和显微技术各种显微镜的基本原理及其样品制备方法第一节微生物的分离和纯培养

从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。一、无菌技术

用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；

（P14第1段）（参见P13、14）一、无菌技术参见P14一、无菌技术参见P141、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：试管、瓶子、培养皿等1887年，RJPetri发明

Petridish参见P14装有培养基后称为“培养平板”

Or“平板”(plate)(具体灭菌方法第6章介绍)高温干热灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：1、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：参见P142、接种操作无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行参见P15二、用固体培养基分离纯培养培养基：液体培养基；固体培养基；半固体培养基；参见P15二、用固体培养基分离纯培养培养基：液体培养基；固体培养基；半固体培养基；固化剂柯赫（RobertKoch）的助手WHeese和他的夫人FranHeese参见P15琼脂二、用固体培养基分离纯培养菌落（colony）：

单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。（P15，倒数第2段）众多菌落连成一片菌苔（lawn）不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据（见P15，倒数第二段；图2-3）。斜面培养基上细菌菌苔特征液体培养基中细菌生长特征二、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：稀释！参见P16二、用固体培养基分离纯培养1、稀释倒平板法2、涂布平板法操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！参见P16二、用固体培养基分离纯培养3、平板划线法参见P16二、用固体培养基分离纯培养3、平板划线法参见P163、平板划线法参见P16二、用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱参见P17二、用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧手套箱参见P17二、用固体培养基分离纯培养4、厌氧微生物的分离稀释摇管法参见P16三、用液体培养基分离纯培养0.0480.048+0.0012+0.0002=0.975

稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。例如：若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，则生长的试管中仅含一个细胞的几率为：4.8%；含二个细胞的几率为：0.12%；含三个细胞的几率为：0.002%在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%参见P17四、单细胞（孢子）分离一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；参见P17～18通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得某一个生态环境（例如1克土壤）中所有种类细菌的纯培养？假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌；不同细菌在数量存在差异；微生物在自然条件下存在的特点：五、选择培养分离

抑制大多数其它微生物的生长；

使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。（P18第2大段）

使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。参见P18五、选择培养分离1.利用选择培养法进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制

高温下培养：分离嗜热细菌；

培养基中不含N：分离固氮菌；

培养基加抗生素：分离抗性菌；参见P18五、选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物

牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；参见P18五、选择培养分离2.富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加参见P182.富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。（P19，第二段）根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；参见P18七、微生物的保藏技术（移到第八章微生物遗传）

微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。（P12第一段）微生物的基本特点：小！参见P13第二节显微镜和显微技术几个基本概念：放大分辨率反差被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！特定条件下能辨析的两点之间的最小距离被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。P21倒数第一段参见P21100%200%800%一、显微镜的种类及原理1.普通光学显微镜普通复式光学显微镜技术－－构造分为三部分：1、光学放大系统：目镜、物镜2、照明系统：光源、聚光镜、各种滤光片3、机械系统：镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒和调节螺旋等一、显微镜的种类及原理1.普通光学显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？目镜：10~15×；物镜：100×；总放大倍数1000~1500×；使用油镜，即在100×物镜和载玻片之间滴加香柏油；参见P22评价显微镜性能参数－分辨率（D）显微镜能够辨别两个质点间最小距离的能力。λ

表示波长N表示标本和物镜之间介质折射率；α表示镜口角；N·sin(α/2)即为数值孔径NA。物镜的镜口角介质为空气时，N＝1，α最大值可达140°，最短的可见波长λ＝450nm，分辨率D＝292nm，约0.3µm。使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N＝1.515）或液体石蜡（N=1.52），分辨率可达0.2µm。所以普通光学显微镜的最大分辨率是0.2µm。1.普通光学显微镜q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离低倍镜的分辨率低于高倍镜参见P22用浸没油取代空气的作用：介质折射率提高分辨率得到提高参见P22第2大段光线在穿过折射率不同的介质时发生折射改变光折射角度增加照明亮度很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。（P22第2大段）浸没油与玻璃的折射率相近光学显微镜物镜的特性人眼的分辨能力在0.2mm左右，因此光学显微镜的最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000×到1,500×。参见P22相差显微镜－原理光线通过未经染色的标本如活细胞时，由于细胞各组分密度的差异和折射率的不同，直射光和衍射光的光程就会有差别，光波的相位发生改变，产生相位差。人的肉眼分辨不出光的相位差异，只能分辨光的波长（颜色）和振幅的差异（明暗差异）。因此，活细胞在普通光学显微镜下观察时，所看到的整个视野的亮度是均匀的。但相差显微镜可将这种光程差或相位差转换成振幅差。相差显微镜的基本原理是把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。相差显微镜可使人们能在不染色情况下清楚地观察到普通光学显微镜下看不到或看不清的活细胞以及细胞内的某些细微结构。相差显微镜光路图①环形光阑：位于光源与聚光器之间，其上有一透明的亮环，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上后产生两部分光，一部分是直射光，另一部分是经过标本后产生的衍射光。②相位板：可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。相位板分为两种：A相板将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本是明亮的而背景是暗的，形成亮反差，称为明相差或负相差；B相板将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本是暗的而背景是亮的，形成暗反差，称为暗相差或正相差。③合轴调节望远镜：用以调节环状光阑和相位板环的重合。④绿色滤光片：由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常用绿色滤光片来调解光源的波长。相差显微镜具有四个特殊结构：1、环状光阑2、相位板3、合轴调节望远镜4、绿色滤光片。一、显微镜的种类及原理3.相差显微镜形成亮背景暗物象的结果（相消干涉）参见P23第2大段一、显微镜的种类及原理3.相差显微镜A相长干涉

B相消干涉（M＋M’为干涉光束的合成波）一、显微镜的种类及原理5.透射电子显微镜；6.扫描电子显微镜分辨率与所用波长成反比！参见P24电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜。

（P24第2大段）电镜的分辨本领和有效放大倍数人眼分辨率：0.2mm普通光学显微镜分辨率：0.2μ,

放大倍数：0.2mm/0.2μ=1,000倍电镜分辨率：0.2nm

放大倍数：0.2mm/0.2nm=1,000,000倍

----有效放大倍数

但电镜分辨率受制样技术技术限制。一般在超薄切片样品中，其分辨率为超薄切片厚度的1/10。例如如果切片厚度50nm。则分辨率为5nm，大大低于0.2nm分辨率。电镜分辨本领：电镜处于最佳状态下的分辨率。电子显微镜的基本构造1、电子束照明系统：电子枪、聚光镜；2、成像系统：物镜、中间镜、投影镜；3、真空系统：4、记录系统图3-11电子显微镜构造和光成像原理1、电子束照明系统：电子枪、聚光镜；2、成像系统：物镜、中间镜、投影镜；3、真空系统：4、记录系统电镜与光镜光路图比较主要电镜制样技术

超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图

负染色技术（Negativestaining）与金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构

冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）

电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

主要电镜制样技术

超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图

负染色技术（Negativestaining） 染色背景，衬托出样品的精细结构

冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）

电镜三维重构技术(自学） 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的