小鼠非酒精性脂肪肝实验模型建立的最佳饲料配比方案

小鼠非酒精性脂肪肝实验模型建立的最佳饲料配比方案目的探讨建立小鼠非酒精性脂肪肝动物模型的最佳饲料配比方案，为进一步开展脂肪肝及其治疗的相关研究提供有价值的实验数据。方法80只KM小鼠随机分为4组，甲、乙、丙为模型组，丁组为对照组。模型组给予不同梯度的高脂饮食，对照组给予正常饮食。在造模后每1周分别取模型组动物各5只处死，观察其病理模型形成情况，做血液指标检测及病理切片；采用全自动生化分析仪检测生化指标；取肝脏，制肝匀浆，测定LTG、LTC。结果造模过程中，模型组动物乙组造模后体重增长较正常对照组及模型组甲组、丙组迅速。至实验结束时，甲组体重较正常组平均重7.62%，乙组体重较正常组平均重16.76%，丙组体重较正常组平均重11.14%，模型动物体重及肝指数均较正常组显著增加（P＜0.01）。生化指标检测显示模型组小鼠的TC、TG、ALT、AST、LDL-C、LTG、LTC水平，均有一定程度的降低（P＜0.01），HDL-C水平显著升高（P＜0.01），其中乙组小鼠的变化幅度最大（P＜0.01）。在病理方面，造模组1周后乙组小鼠最早出现了轻度的肝脂肪变，造模2周乙组小鼠多呈中度脂肪变。造模4周乙组小鼠呈中重度的大泡性脂肪变。结论适当的高脂高胆固醇配比饮食是一种快速有效的脂肪肝模型制作方法。标签：非酒精性脂肪性肝炎；动物模型；肝指数；动物实验Non-alcoholicfattyliverinmiceexperimentalmodelsofoptimalfeedratioofprogramsYAOPeng，QIAn-long，ZHANGYu，etal.TianjinMedicalUniversitySchoolofClinicalMedicine，Tianjin300270，China【Abstract】ObjectiveExploretheestablishmentofnon-alcoholicfattyliverinmiceanimalmodelsoffeedratioofthebestprograms.Methods80KMmicewererandomlydividedinto4groupsA，B，Casamodelgroup，Dasthecontrolgroup.Modelgroupweregivendifferentgradientofhigh-fatdiet，normaldietcontrolgroup.Theninanotherweekwecollectedfiveeachfromthefivemodelgrouprandomly.Andthenkilledthemtoobservetheformationofpathologicalmodel，todobloodtestinganddobiopsy，anddetectedbybiochemicalanalysisofserumbiochemicalindicatorsandtheliver，liverhomogenatesystemmeasuredLTG，LTC.Theresultsofthemodelingprocess，themodelgroupBincreasedthefastestthantheotherss.Comparedwiththeaverageweightofthenormal，totheendoftheexperiment，groupAwere7.62%heavier，groupBwere16.76%，groupCwere11.14%，themodelanimalweightandliverindexincreasedsignificantlycomparedwiththenormalgroup(P＜0.01).BiochemicaltestsshowedthemodelgroupmiceTC，TG，ALT，AST，LDL-C，LTG，LTClevel，thereisacertaindegreeofreduction(P＜0.01)，HDL-Clevelsweresignificantlyincreased(P＜0.01)，wherethesharpestchangeingroupBmice(P＜0.01).Inpathology，afteraweekthegroupBfirstappearedinthemildhepaticsteatosis，groupB，2weeksafter，mostlyappearmoderatefattychange.Modelingfor4weeksingroupBmiceshowedseveremacrovesicularfattychange.ConclusionTheratiooftheappropriatehigh-fathigh-cholesteroldietisafastandefficientproductionmethodoffattylivermodel.【Keywords】Non-alcoholicsteatohepatitis；Animalmodel；Liverindex；Animalexperiments目前，非酒精性脂肪性肝炎的发病率为1.2%～4.8%，随着人民物质生活的改善，非酒精性脂肪性肝病的发病率将逐年上升。在某些地区脂肪肝已超过病毒性肝炎而成为第一大肝病。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD)在欧美地区、亚太地区很多国家内引起慢性肝功能异常隐源性肝酶升高最为常见的原因，也几乎是至少60%的病因迄今不明的肝硬化病例的基础病因。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)是NAFLD的一种病理类型，是进展性疾病，可以发展为肝硬化、肝功能衰竭和肝癌等终末期肝病，其病理生理机制尚不完全清楚。疾病的发病机制只有通过与疾病相似的合适动物模型才可以得到阐明，本课题采用了高脂饮食复制非酒精性脂肪性肝炎的动物模型，观察非酒精性脂肪性肝炎的动物模型的病理变化特点和探讨最佳的饲料配比方案。1材料与方法1.1实验动物KM小鼠，清洁级，小鼠体重为（25.3±1.8）g。1.2实验试剂胆固醇(上海源聚生物科技有限公司生产，批号：080502)；胆酸（中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20070120）；猪油、蛋黄粉、普通饲料（市购）；生理盐水。1.3实验仪器美国贝克曼CX5PRO全自动生化分析仪，尼康YS100和尼康E200显微镜、加拿大显微摄像系统PL-B681CU，上海良平仪器仪表公司JA3003电子天平，沈阳龙首电子仪器公司LS-2055AT+全自动石蜡切片机1.4动物分组及处理50日龄以上雌鼠200只，随机取其中80只，并把KM80只小鼠随机分为甲、乙、丙、丁四组各20只。甲、乙、丙为实验模型组，丁组为正常对照组，甲、乙、丙三组给予不同梯度高脂饮食复制非酒精性脂肪性肝炎模型。见表1。高脂饮食由普通饲料加猪油，蛋黄粉，胆固醇，胆酸组成。在造模后每1周分别取模型组动物各5只处死，观察其病理模型形成情况，做血液指标检测及病里切片。分别在第2周。第4周末将小鼠用2%戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔注射，麻醉后下腔静脉取血，将血标本离心后用于血脂检测；取肝左叶，用10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，作肝组织病理学观察。1.5观察指标及检测1.5.1一般项目观察动物的体重、饮食、毛发、活动情况、肝/体重比等。1.5.2血脂检测动物处死前，采取各组动物血液分离血清，采用全自动生化分析仪检测。1.5.3病理学观察取新鲜肝组织左叶，用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋5μm切片，HE染色作肝组织病理学观察，了解肝组织脂肪变性、炎症活动程度。1.6统计学方法应用SPSS11.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，采用t检验，计数资料比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1动物的一般情况实验期间正常组动物精力充沛，灵活好动，饮食正常，皮毛整洁，体重缓慢增加；模型组饮食量大，嗜睡，毛色偏黄，个体较大，体重增长较正常组快，模型组动物乙组造模后体重增长较正常对照组及模型组甲组、丙组迅速，至2周时，甲组体重较正常组平均重6.21%，乙组体重较正常组平均重12.41%，丙组体重较正常组平均重9.85%，至4周时，甲组体重较正常组平均重7.62%，乙组体重较正常组平均重16.76%，丙组体重较正常组平均重11.14%。模型组小鼠有不同程度的精神萎靡，活动减少，其中乙组小鼠尤为严重。2.2体重和肝指数四组小鼠体重、肝指数变化情况，模型组乙组较正常组和模型组甲、丙两组体重及肝指数均显著增加（P＜0.01）。2.3血液指标模型组乙组与正常组和模型组甲、丙两组相比，HDL－C降低，差异有统计学意义（P＜0.05）TC、TG、ALT、AST、LDL-C、LTG、LTC明显升高，差异具有显著性（P＜0.01）。2.4肝脏病理学变化2.4.1肉眼观察正常组小鼠肝脏形态正常，4周时无一例出现异常。模型组乙组小鼠造模2周起肝脏外形稍饱满圆钝，质地较脆，色红；3周肝脏体积增大，包膜紧张，色灰黄，切面油腻；4周时，模型组乙组动物肝脏明显增大，包膜紧张，边缘较钝，质地略软，色黄，表面呈花斑状，触之似泥块并有油腻感，部分大鼠肝脏有黄白色的局灶性脂肪沉积。模型组甲、丙两组，造模3周起肝脏外形稍饱满圆钝，质地较脆，色灰红；4周肝脏体积增大，包膜紧张，色泽灰白，切面油腻。2.4.2光镜观察（10×40倍HE染色）正常组肝小叶结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。无肝细胞肿胀及脂肪变(图1)。模型组乙组肝组织HE染色显示：造模2周后乙组小鼠肝脏即有轻微的肝细胞脂肪变性，标本还出现汇管区及小叶内炎症细胞浸润和散在的点状坏死。造模3周乙组小鼠多呈中度脂肪变，且炎症活动积分明显高于造模1～3周小鼠，可见到小叶内炎症，炎症细胞主要以单核细胞为主，炎症程度明显加重（图3）。造模4周乙组小鼠呈中重度的大泡性脂肪变，脂滴分布密度增大，可见大部分肝细胞浆含大脂滴，部分脂滴形成大空泡，将细胞核挤压至一边，且以中央静脉周围为甚；肝小叶结构破坏，肝细胞排列不规整，并伴大量肝细胞肿胀。模型组甲、丙组肝组织HE染色显示：造模3周后甲、丙两组小鼠肝脏即有轻微的肝细胞脂肪变性，标本还出现汇管区及小叶内炎症细胞浸润和散在的点状坏死。造模4周小鼠多呈中度脂肪变，且炎症活动积分明显高于造模1～3周小鼠，可见到小叶内炎症，炎症细胞主要以单核细胞为主，炎症程度明显加重。3讨论脂肪肝是一种多病因引起的、病变主体在肝小叶，以肝细胞内中性脂肪异常沉积为主的临床病理综合征。近年来，人们对非酒精性脂肪性肝炎的研究日益增多，发现它不仅可以发展为肝纤维化、肝硬化并致一系列严重并发症，甚至可以发展成肝癌，早期认识并治疗非酒精性脂肪性肝炎对阻止慢性肝病进展和改善预后具有重要意义。众所周知，脂肪肝的成因非常复杂，这为其病理模型的研究和治疗带来很大的难度。动物模型在探索脂肪肝的发病机制、评价诊断方法、筛选防治药物等领域均有重要作用。研究不同方法不同原因造成的脂肪肝动物模型对阐明脂肪肝的发病机制和治疗必然会产生积极影响。目前，国内外学者们根据脂肪肝的病因，设计出多种造模方式，如高脂饲料喂养，酒精损害，毒物损伤（CCl4、乙硫氨酸），复合因素（乙醇-高脂饮食-CCl4）等。各种动物模型的形成机制及病理改变各异，实验者可根据研究目的选择合适的动物模型。本研究选用的利用高脂饲料喂养建立的脂肪肝模型小鼠与人类疾病特征相似，病变有一定发展过程，同时形成率高，死亡率低，重复性好，造模方法简便易行。其主要通过改变高脂饲料喂养模型小鼠的饲料配比方案来进行对比试验，主要方法是通过改变猪油，蛋白粉，胆固醇，胆酸以及普通饲料的比例，来验证出一种利用高脂饲料制造动物模型的最佳饲料配比方案。结果显示乙组（10%猪油，10%蛋黄粉，4%胆固醇，1%胆酸，普通饲料75%）配方明显比其他组配方更容易建立小鼠非酒精性脂肪肝实验模型。虽然此实验已经成功，但小鼠与人在脂类代谢机制上有很多不同之处，因此，具体机制还有待进一步实验探讨。参考文献［1］张一琚.脂肪肝的临床及流行病学特征.华人消化杂志，1998，6(特刊7)：442-443.［2］范建高.中国脂肪肝的研究.世界华人消化杂志,2001,9：6-10.［3］WangJT，LiuYL.Non-alcoholicfattyliverdisease：theproblemswearefacing.HepatobilPancreatDisInt，2003，2：334-337.［4］徐正婕，范建高，王国良，等