免疫分析技术基本原理

免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。抗原抗体反应的特性1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。最适比例4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平。酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。固相免疫测定的原理基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。双抗体夹心法原理此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。双抗原夹心法原理用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高校准品/标准品标准品：1、国际标准品：由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。如FDA的标准品。

2、国际生物学活性标准品：根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。

3、参考标准血清：国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。如HBsAg的国家标准血清盘。校准品：使测量值具有可比性的对照物质。对于测量血清标本的检验手段来说，最佳的校准品应该是用决定性方法定值的新鲜混合血清。校准品具有系统专一性，不同系统的校准品不能混用（例如不同厂家或者不同批次的“标准品”不能替换使用）。我们定量产品中通常所说的标准品严格以上来说应当叫校准品，校准品往上溯源才是标准品。ISO17511对控制品有较为详细的说明。质控品/内控品质控品（control）：是已有靶值的对照物质，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控品检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。IVD行业中，通常使用的质控品有卫生部临床检验中心（NCCL）提供的定值质控品。在临床实验室中，经常使用各省疾控中心（CDC）发放的定值质控品。各临床实验室每年还在第三方（通常由各省的相关领导部门担任）的组织下进行室间质评，以评价实验室的总体检验水平。内控品：由实验室参照权威机构标准品或质控品自己标定的对照物质，用于控制本实验室的实验误差。质控品和内控品都要保证其溯源性！！！成品成品：通俗来说就是符合客户要求和满足法律法规要求，可以直接交货或售卖的产品。比如试组装完毕、检验合格，贴上合格签的试剂盒。对于国家批批检的产品，必须还要有国家相关检验机构出具的合格检验报告，并经过相关机构做出合格标示的试剂盒才能算成品试剂盒。成品与半成品是公司内对生产流程的分类，可是对外，就没有什么成品和半成品之分了，如果客户要买你的“半成品”，那么“半成品”也就变成你们的成品了，如果客户不买你的“成品”，那么你的“成品”则连半成品也不是！所以我们一定要把东西卖出去。半成品/中间品半成品：通俗来说，品质要求已达到客户要求，但还需要经过一道或几道后序加工程序才能成为成品的产品，通常的后序加工程序指的是组装。例如：检验合格的包被板，分装并检验合格的酶结合物和标准品等。中间品：半成品生产过程中所处的合格的形态。例如：包被后检验合格的包被板，分装前检验合格的酶结合物和标准品。无论是成品、半成品还是中间品，必须强调检验合格的概念！质量检验质量检验：对产品的一个或多个质量特性进行观察、测量、试验，并将结果和规定的质量要求进行比较，以确定每项质量特性合格情况的技术性检查活动。质量检验的职能：鉴别、把关、预防、报告、监督。质量检验的步骤

(1)检验的准备。熟悉规定要求，选择检验方法，制定检验规范。在检验的准备阶段，必要时要对检验人员进行相关知识和技能的培训和考核，确认能否适应检验工作的需要。

(2)测量或试验。按已确定的检验方法和方案，对产品质量特性进行定量或定性的观察、测量、试验，得到需要的量值和结果。测量和试验前后，检验人员要确认检验仪器设备和被检物品试样状态正常，保证测量和试验数据的正确、有效。

(3)记录。对测量的条件、测量得到的量值和观察得到的技术状态用规范化的格式和要求予以记载或描述，作为客观的质量证据保存下来。质量检验记录是证实产品质量的证据，因此数据要客观、真实，字迹要清晰、整齐，不能随意涂改，需要更改的要按规定程序和要求办理。质量检验记录不仅要记录检验数据，还要记录检验日期、班次，由检验人员签名，便于质量追溯，明确质量责任。

(4)比较和判定。由专职人员将检验的结果与规定要求进行对照比较，确定每一项质量特性是否符合规定要求，从而判定被检验的产品是否合格。质量控制/质量保证质量控制（QuailityControl,Q.C）：质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。

1）确定控制的对象；

2）规定控制对象的标准（预期值）；

3）制定或选择控制方法和手段；

3）测量实际数据；

4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。

5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。质量保证（qualityassurance,Q.A）：提供质量要求会得到满足的信任的一系列活动。质量保证的关键词是“提供信任”，提供信任的对象对内可以是管理者，对外可以是顾客；“提供信任”的

方法是需要提供能够证实质量要求会得到满足的证据。

对内或对外提供产品质量保证文件、过程监控记录、质量手册或认证证书，都可以作为“提供信任”的方法。基质效应基质效应（matrixeffect）：基质指的是样品中被分析物以外的组分，基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。基质效应表现在两个方面：1.标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。2.基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。基质偏差（matrixbias）基质效应所致分析结果的偏差称为基质偏差。用作校准物质或质控物的经过处理的混合血清，由于血清基质的理化性质在处理过程中的改变，在常规测定上往往出现基质偏差。基质偏差的出现也与分析系统（包括方法、试剂及所用仪器设备）有关，所以有人将基质效应定性为方法、材料与基质的特异性反应。国外已有不少文献指出某些在制备过程中经过加工或添加某些成分(如制备的LDL)的参考血清，会在某些分析系统中出现基质效应(matrixeffect)，而使标本(新鲜血清)的分析结果出现明显偏差。用新鲜血清为参考材料是最理想的，但显然是不现实的，所以对参考材料的研制又提出了新的难题。Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。改进仪器设计及试剂组成。选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。HOOK效应高值钩镰效应（HD-HOOK）在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂（HIGHDOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）根据此现象写实性地称之为“HD-HOOK”效应。在一步法和两步法中均有HOOK效应一步夹心法HOOK效应实际上是一种“浓度效应”，待测物中抗原数量过高所致次要因素：标记抗体与被捕捉抗原的交叉重叠结合而导致抗原变构只要靶抗原的正常值与病理值之差大于3个数量级，均应警示由于严重的“HD-HOOK效应”而发生的假阴性，假低值两步夹心法HOOK效应仅发现于少数具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原如：SF、AFP、PSA、HCG等）。随着杂交瘤单抗的问世，Femando等设计了一个堪称现代经典的实验模式,使这一课题的研究取得了突破性进展。所选用的试验方法是二步IRMA,靶抗原是一个已知其WM为22kDa、仅有二个不同抗原簇的人生长因子(hGH)。一个单抗用于包被,另一个作125I标记作二抗。用此实验系统,测定单体hGH抗原时,没有发现“HD-HOOK效应”问题奇怪的是,用同样实验系统,测定非共价结合的二聚体(D)-hGH则呈现了“HD-HOOK效应”。据此实验结果,推导出一个新理论:即标记二抗介导被捕捉抗原分子发生分子变构‘(Confromationalchange)’,使之形成标记二抗与变构的抗原分子复合物,从固相一抗上解离,最终产生反应信号减低的“HD-HOOK”效应。这种“抗原分子变构理论”的核心是抗原的“质”的问题。理论依据首先,大分子蛋白质抗原的可变构性是决定性的内因。其中构象性决定簇是几条肽链(非连续性)提供的氨基酸组合而成的,比线性(连续性)决定簇的稳定性差,易发生变构(见图2)。其次,蛋白质分子内非共价结合键,也是发生分子变构的内在因素。从现有资料看,仅报道铁蛋白、AFP、PSA及HCG等,具有多重决定蔟的大分子抗原,在二步法中产生“HD-HOOK效应”。小分子抗原则否。表明抗原“质”的特性是关键性因素。其次,抗体分子是介导抗原分子变构的重要外因。已知Igs分子在遇到相应抗原时,为了执行其固有的(本质性)生物学功能,其分子的Fab臂可围绕铰链区,作变角折弯(>100°)、锥形转动以及最N末端的可变区,依托Fab的恒定区作微小的“球穴”摆动(见3)。当其与被捕捉抗原分子之间,发生交差重叠结合之后,由于“立体效应(stericeffect)”,加之标记二抗的亲和力大于一抗等辅助因素,是可以迫使已被捕捉的抗原分子从一抗上解离洗涤出去的。很可能与下列因素有关：包被-抗体亲和力低洗涤不合适酶标抗体不足过度孵育其他非特异性反应窗口期窗口期（windowperiod）：病毒感染后病毒出现在血液中直到可以检出足够多的相应病毒标志物（抗原或抗体）前的时期。在这段时间内，血清中无法检测出相应的抗原抗体标志物。各种病毒的窗口期是不一样的，一般所称的窗口期指的是检测到病毒抗体的时间，但抗原以及核酸检测同样存在窗口期，但时间大大缩短。HBV、HCV、HIV的窗口期的时间分别为56、70和22天，P24抗原的窗口期平均为15天，而应用核酸技术，可分别将HBV、HCV、HIV的窗口期缩短为41、12、11天。由于检测技术的局限，某种检测结果为阴性并不意味着就没有感染，因此定期复查是非常重要的。相信随着检测的病毒标志物的不同，检测技术的提高，可大大缩短窗口期时间。心理窗口期还有一个很重要的“心理窗口期”。由于医学上还没有绝对明确的窗口期，有个别朋友甚至2年以后还在检查，不知道他们还要在恐惧中多久才能找到回家的路！所以，每个人都应该在深思熟虑后为自己确定一个明确的心理窗口期，也就是说，过了这个期限还是阴性就可以彻底放心，之后的任务就是如何恢复到以前的生理和心理状态，回到自己以前的生活中去。潜伏期潜伏期（incubationperiod）是指病原体侵入机体到最初出现症状和体征之间的这段时期。各种疾病的潜伏期长短不一，短者数小时，长者可达数月或数年。如禽类禽流感的潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。人类患上禽流感后，潜伏期一般为7天以内。非典型性肺炎的潜伏期一般在4—10天，临床报告最短病例为1天，最长有20天，甚至有极个别病例达到28天。一般认为潜伏期长短与感染病毒的种类或者型别、病毒的致病性、病毒的数量、感染途径、被感染机体的免疫力以及其他非生理因素等有关。比如艾滋病病毒，经输血感染的剂量一般较大，所以潜伏期相对较短，而性接触感染艾滋病病毒的剂量较小，因此潜伏期相对较长。HBV感染后的潜伏期一般为20天至6个月，也有报道28—160天，平均70—80天；HCV感染后临床表现一般较轻，常为亚临床型，但输血后感染的潜伏期一般为20天至6个月，也有资料报道2—26周，平均8周；HIV感染后1到2个月内可能出现急性的症状和体征，随后进入较长的无症状期，持续6—15年，平均8—10年，大量输血的可缩短至1—5年。梅毒的潜伏期一般为2—4周灰区灰区：把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。灰区的设置有二种：1）C.O×（1±CV），CV为该试剂的批内CV(一般在15-20%间）；2）C.O±2s，s为实验室做室内质控ROC（受试者工作特征曲线）的s。酶免疫吸附实验（EIA）的性能指标（定性产品）灵敏度灵敏度（sensitivity）：某一检测系统检出极低被检物质的能力。包括两层意思：1.检出被检物质最低量的能力；2.对大量样品中阳性检出的能力。检出被检物质最低量的能力：常用检出最低量被检物的含量（即分析灵敏度或最低检出限）来表示。比如0.1ng,0.1mIu,0.1NCU等，意思是在某一检测方法下，检测系统能将有用信号和背景信号区分开来时所对应的被检物的浓度。但这种区分在目前的条件下是否在临床上有确切的意义并不能全部的肯定。评价方式：用标准被检物持续稀释，直到能区分有用信号和背景信号的最大稀释倍数。也叫滴度。在ELISA实验里，常用强阳性混合血清系列稀释，同时用市场反应较好的试剂盒同时进行标定，选择这些试剂盒都能检出的最大稀释倍数的血清作为灵敏度血清，通常会有成系列的几个血清。在标定系列灵敏度血清的时候要非常注意一个问题：要注意基质效应在不同系统（包括不同厂家的试剂盒、工艺、不同原材料）上对灵敏度血清测量值的影响，在改变系统时，必须重新标定灵敏度血清。2.为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好），取决于包被物的全面性和亲和力。选择原材料一定要选择亲和力高的原料。有些厂家为追求试剂对大多数阳性标本的灵敏度，只选择最强的一种或少数几种优势表位，而牺牲了在患者人群中较少出现的亚型或者原材料片段，这种做法是非常危险的，是对目标人群的不负责任。特异性特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性，生产工艺对试剂的特异性也有较大影响。可能影响试剂盒特异性的一些因素操作因素：交叉污染、洗涤不彻底。试剂盒工艺：试剂盒在生产的时候被污染了。交叉：相似于被检物的物质交叉反应，主要由生物原材料不纯造成。标本因素：高度溶血、脂血标本。血清标本处理：抗凝剂、反复冻融。其它存在于血清中的物质对检测结果的影响，如胆红素、胆固醇、甘油三酯等。准确度准确度（accuracy）：是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。在ELISA实验中，真值往往指的是用决定性方法（即“金标准”）测量所得到的结果。准确度是灵敏度和特异性的综合指标，是试剂盒质量最主要的指标之一。精密性精密性（Precision）：是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间的符合程度。常用变异系数来表示。CV=SD/X×100%其中，X为检测均值，SD为连续测定的标准差。变异系数分为批内变异和批间变异。ELISA试剂一般指其批内变异系数（CV），其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。影响检测精密性的因素操作