仪器分析9-经典液相色谱法

概述流动相是液体的色谱法称为液相色谱法（LC）。液相色谱可分为平面色谱和柱色谱，前者如纸色谱和薄层色谱，后者如离子交换柱色谱、硅胶柱色谱等。1.液相色谱法的类型1.1按分离原理不同分类：吸附色谱法：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离的。分配色谱法：利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数的差别而实现分离的。离子交换色谱法：不同离子与固定相相反电荷间的作用力大小不同。体积排阻色谱法：固定相孔径不同，把样品组分按分子大小分开。1.液相色谱法的类型柱色谱法：固定相装在管柱内的色谱法平面色谱法：（1）纸色谱法（2）薄层色谱法1.2按操作形式不同分类：1.3按分离效能不同分类：经典液相色谱法、现代液相色谱法2.液相色谱的固定相和流动相2.1吸附色谱法的固定相和流动相(1)基本原理吸附色谱法是基于吸附效应的色谱法，以固体吸附剂为固定相，以液体为流动相。吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种色谱类型。2.液相色谱的固定相和流动相色谱分离物质的依据是吸附剂表面与溶质分子中官能团的吸附与解吸的相互作用，是溶质分子和容积分子对固定相的竞争吸附的结果。2.液相色谱的固定相和流动相(2)固定相吸附色谱的固定相种类较多，按化合物的性质可分为有机吸附剂和无机吸附剂。有机吸附剂包括活性炭、淀粉、聚糖、聚酰胺、大孔吸附树脂等。无机吸附剂包括氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、硅藻土等。2.液相色谱的固定相和流动相①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速通过色谱柱。④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。1）对吸附剂的要求2.液相色谱的固定相和流动相硅胶为极性吸附剂，表面主要存在着硅羟基（硅醇基）和暴露于表面的Si-O-Si键，另外还有一些硅醇基可能与水以氢键键合。硅羟基的表面浓度在吸附色谱中很重要，因为人们通常认为硅羟基是强吸附位点，而Si-O-Si则是疏水性的。自由型硅醇基硅氧烷型①硅胶（SiO2·H2O）2）常用无机吸附剂结构：

内部——硅氧交联结构→多孔结构表面——有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心表面硅醇基存在形式：SiOH2.液相色谱的固定相和流动相2.液相色谱的固定相和流动相吸附特性：易吸水→失活

活化：铺好的硅胶板自然晾干后，在烘箱中于→105～110℃烘干0.5~1h(可逆失水)→吸附力最大高温：→500℃烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力与极性物质形成氢键物质极性↑，吸附能力↑，K↑，tR↑适用：分析酸性或中性物质2.液相色谱的固定相和流动相干燥表面物理吸附水2.液相色谱的固定相和流动相碱性氧化铝

pH9～10

适于分析碱性、中性物质中性氧化铝

pH＞7.5

适于分析酸性碱性和中性物质酸性氧化铝

pH4～5

适于分析酸性、中性物质氧化铝一般是由氢氧化铝脱水制得，根据制备时pH值的不同，分为：氧化铝的活性与其含水量相关。②氧化铝2.液相色谱的固定相和流动相氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物。当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性易离解的化合物容易在氧化铝上形成死吸附。氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。2.液相色谱的固定相和流动相硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活性大大降低。2.液相色谱的固定相和流动相硅胶和氧化铝的含水量与活度的关系活性级越大，含水量越多，吸附能力越小，活性越小活性≠活度吸附能力吸水量2.液相色谱的固定相和流动相为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。①聚酰胺3）常用有机吸附剂2.液相色谱的固定相和流动相聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通过分子中的酰胺羰基与酚类，或酰胺键上的游离氨基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种化合物与之形成氢键缔合的能力。聚酰胺的吸附原理如图：分离原理：吸附强弱取决于：化合物与聚酰胺形成氢键的能力。2.液相色谱的固定相和流动相①形成氢键的基团越多，则吸附力越强；聚酰胺对化合物的吸附力在水中有下列规律：2.液相色谱的固定相和流动相②易形成分子内氢键，则吸附力减弱；2.液相色谱的固定相和流动相③芳香核、共轭双键多者吸附力大；>2.液相色谱的固定相和流动相2.液相色谱的固定相和流动相聚酰胺“双重色谱”原理正相色谱非极性固定相（非极性脂肪链）含水溶剂（甲醇-水，极性大）苷（极性大）（柱色谱分离）苷元<苷极性固定相（极性酰胺基团）有机溶剂（氯仿-甲醇，极性小）游离黄酮（苷元，极性小）苷元>苷聚酰胺：洗脱剂：先洗脱：Rf值：反相色谱④聚酰胺柱色谱属于双重色谱：当流动相为水-醇系统时，其为反相色谱；当流动相为氯仿-甲醇系统时，其为正相色谱。2.液相色谱的固定相和流动相又称全多孔树脂，因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。②大孔吸附树脂主要用于水溶性化合物的分离及纯化，如皂苷、其它苷类物质等。2.液相色谱的固定相和流动相各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附能力差异而实现分离。常用吸附剂：多孔、微粒状物质吸附能力大小取决于吸附中心的多少和吸附中心与被吸附组分形成氢键能力的大小。硅胶氧化铝聚酰胺(3)吸附色谱的条件选择色谱条件的选择依据被测组分、吸附剂和流动相的性质。——极性2.液相色谱的固定相和流动相1）被分离组分的结构性质（极性大小）判断物质极性大小的规律：①基本母核相同，分子中基团的极性越强，整个分子的极性也越强。②分子中双键越多，吸附能力越增，共轭双键多吸附力亦增大。③化合物基团的空间排列对吸附性也有影响。如能形成分子内氢键的要比不能形成分子内氢键的相应化合物的极性要弱，吸附能力也弱。2.液相色谱的固定相和流动相2）吸附剂和流动相的选择吸附剂的活性：吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强强极性物质——选择弱吸附剂弱极性物质——选择强吸附剂流动相的极性：流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大

“相似相溶”原则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相常用的流动相极性递增的次序是：石油醚＜环已烷＜四氯化碳＜苯＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。2.液相色谱的固定相和流动相必须同时兼顾被测物的性质、吸附剂的活性和流动相的极性等三方面。一般原则是：若被分离组分极性较小，宜选用吸附活性较大的吸附剂和极性较小的洗脱液；反之，则应选择吸附活性小的吸附剂和极性较强的洗脱液。3）选择方法2.液相色谱的固定相和流动相被测物质的极性、吸附剂活性和流动相极性之间的关系示意图

2.液相色谱的固定相和流动相吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂，主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及pH值，即进行所谓正相色谱。流动相溶剂极性越大，洗脱能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小，洗脱能力越弱，溶质保留越大。2.液相色谱的固定相和流动相2.2分配色谱的固定相和流动相分配色谱法，基于样品组分在固定液和流动相之间分配系数不同而分离的色谱法。(1)基本原理流动相和固定相均为液体，作为固定相的液体是涂在很细的惰性载体上。2.液相色谱的固定相和流动相分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液。涂渍了固定液的载体2.液相色谱的固定相和流动相正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性，适用于极性化合物的分离。反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性，适用于非极性化合物的分离。为了防止色谱过程中两相的混溶，流动相与固定相的极性必须不同。2.液相色谱的固定相和流动相(2)固定液正相色谱法：采用极性固定相(如水、甲醇、甲酰胺等)

反相色谱法：一般用非极性固定相(如硅油、液体石蜡)(3)载体原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体。一般常用硅胶、硅藻土、纤维素等。结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种。2.液相色谱的固定相和流动相流动相一般采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端。(4)流动相2.液相色谱的固定相和流动相正相色谱法：相对非极性的疏水性溶剂，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物，极性小的组分先洗出。反相色谱法：水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先洗出。2.液相色谱的固定相和流动相2.3离子交换色谱法的固定相和流动相(1)基本原理带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。2.液相色谱的固定相和流动相离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。2.液相色谱的固定相和流动相阳离子交换剂：强酸型和弱酸型

可电离的基团磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型

可电离的基团伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3

）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3）(2)离子交换剂的分类2.液相色谱的固定相和流动相(3)离子交换树脂的性质重量交联度：树脂中所合交联剂的百分率。

树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择性；另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强度高。但是如果交联度过大则对水的膨胀性能差，交换反应的速度慢，因此要求树脂的交联度一般为8-12％。1)离子交换树脂的特性二乙烯苯2.液相色谱的固定相和流动相交换容量：离子交换树脂的交换容量表示其可交换离子量的多少。

其表示单位有以下两种：一是质量表示法，即单位质量离子交换树脂吸着能力，通常用mmol/g表示；另一种是体积表示法，即单位体积离子交换树脂的吸着能力，通常用mmol/mL表示。

在表示交换容量时，应把交换树脂上可交换离子的形态阐述清楚，因为离子交换树脂形态不同，其质量和体积也不相同。2.液相色谱的固定相和流动相溶胀：干树脂在水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度。溶胀的程度取决于交联度的高低，交联度高，溶胀小；交联度低，溶胀大。粒度：树脂颗粒大小，一般是以溶胀状态所能通过的筛孔来表示。2.液相色谱的固定相和流动相2)影响选择性系数的因素

树脂选择性是指离子交换树脂对不同离子亲和力强弱的反应。影响离子交换树脂选择性的因素：离子的水化半径：离子在水溶液中通常发生水化作用，离子在水溶液中的实际大小以水化半径来表征。水化半径越小的离子越易被交换。离子的化合价：离子的化合价越高，其与树脂的亲和力越强，越易被树脂交换。2.液相色谱的固定相和流动相(4)离子交换色谱的流动相①调节流动相的pH，使目的物粒子在此pH下失去电荷，甚至带相反电荷，从而丧失与原离子交换树脂的结合力。②用高浓度的同性离子根据竞争作用的大小，将目的物离子取代下来。2.液相色谱的固定相和流动相2.4空间排阻色谱法根据流动相的不同，可分为：

凝胶渗透色谱：有机流动相

凝胶过滤色谱：无机流动相(1)基本原理空间排阻色谱也称凝胶色谱、分子排阻色谱等。2.液相色谱的固定相和流动相软质凝胶：如葡聚糖。因其不耐压（0.1MPa左右即被压坏），只能用于低压凝胶层析。半刚性凝胶：如聚苯乙烯凝胶。能耐较高压力，具有可压缩性、能填充紧密、柱效高。但在有机溶剂中的溶胀性会导致孔径发生变化。刚性凝胶：如多孔硅胶和多孔玻璃珠。在有机溶剂中不溶胀、孔尺寸固定。但不易装填紧密、装柱时易碎，以柱效较低。对蛋白质有吸附；不能在强酸性和强碱性条件使用。(2)固定相2.液相色谱的固定相和流动相常用凝胶有：葡聚糖凝胶G、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯凝胶、葡聚糖凝胶LH-20、无机凝胶等。2.液相色谱的固定相和流动相(3)凝胶和流动相的选择凝胶的选择：①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；③颗粒大小均匀，具有一定的孔径分布范围；④机械强度高，允许较高的操作压力。2.液相色谱的固定相和流动相功能组别分离（脱盐）：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；分级分离：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。大分子物质中除去小分子物质时，选用交联度大的型号；小分子物质与大分子物质分离，选择交联度小的型号。2.液相色谱的固定相和流动相(4)流动相一般水溶性试样选择水溶液为流动相，而非水溶性试样则选择四氢呋喃、氯仿、甲苯等有机溶剂为流动相。3.经典液相柱色谱法硅胶吸附柱色谱是较为常用的经典液-固吸附色谱，可用于分离极性至弱极性的化合物。3.1