实验一 质粒制备1

分子生物学实验课程生物技术概念与特征定义：

利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。特征：21世纪最具潜力的高新技术多学科、交叉、综合的技术影响最为深远最广泛的技术

基因工程的概念

利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞基因工程技术基因工程的应用1、生命科学基础理论研究2、在医学中的应用3、工业中的应用4、农林牧渔业中的应用基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库4、筛选——挑选含有目的基因的重组子5、目的基因表达本课程通过GSTZ基因克隆实验，使大家对分子生物学有一个感性的认识。分离GSTZ基因（质粒DNA提取）PCR扩增限制性内切酶切割载体和目的基因载体和目的基因的连接连接子转移入受体细胞重组子筛选目的基因表达及酶活性分析实验一：细菌质粒DNA的碱法制备

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。

DNA片段的获得1、从基因所在的生物体直接取得2、人工合成DNA片段（DNA合成仪）3、PCR反应合成DNA4、mRNA反转录成cDNA

质粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pMID-GSTZ3.5Kb共价、闭合、环状的DNA分子要去除的物质：蛋白基因组DNARNA脂类及小分子杂质一、提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNADNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。细菌裂解的方法：

碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒二、碱裂解法提取质粒DNA的实验原理

碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。三、实验仪器、材料与试剂

（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMID-GSTZ质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂：溶液I基本成分：10mMTris－HCl,1mMEDTA(pH8.0) 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活其它可能添加成分：50mMGlucose，增加溶液密度溶菌酶，降解细胞壁RNaseA，降解释放的RNA

溶液II0.2MNaOH,1%SDS

作用：裂解细胞壁和细胞膜，核酸和蛋白质变性。溶液III3MKAc(pH5)

作用：性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA分子所带电荷平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA四、实验步骤接种含pMID-GSTZ质粒的大肠杆菌到含有60μg/mlAmp抗生素的LB液体培养基

370C，190rpm振荡培养过夜

取1.5菌液入1.5ml的dorf管中

6000～10000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体（重复一次）

150uL溶液I悬浮菌体（充分振荡或吹打）

加入250uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体1.集菌2.悬浮3.裂解

加入200uL溶液III（柔和混匀），冰上静置5~15min质粒DNA复性

12000rpm，离心10min，取上清到一新管中

加入0.6倍体积异丙醇(充分混匀），室温放置20min

12000rpm，离心10min，弃上清，沉淀室温干燥

加入400ul溶液I溶解，37℃消化30min以上

加等体积的酚：氯仿：异戊醇（充分混匀），室温放置5min

12000rpm，离心10min，取上清到一新管

上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），-20℃30min以上

4.中和5.去除蛋白及染色质6.异丙醇沉淀7.消化RNA8.去除蛋白9.乙醇沉淀12000rpm，4℃离心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤1～2次（振荡混匀、离心）

12000rpm，4℃离心10min

室温风干

沉淀用20~100uLRTE溶解，-200C保存10.洗涤11.溶解注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！取1.5菌液离心集菌，重复一次

6000～10000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体(重复收集一次）

150uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min

加入250uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体

加入200uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5~15min质粒DNA复性

12000rpm，离心10min，取上清到一新管中

加入0.6ml异丙醇(充分混匀），室温放置20min

12000rpm，离心10min，弃上清，沉淀室温干燥

加入50ulTE溶解后，取10ul放入新管中；剩余40ul中加入460ul溶液I混匀，37℃消化30min以上

加等体积的酚：氯仿：异戊醇（充分混匀），室温放置5min

12000rpm10min，取上清到一新管

上清加1/10体积溶液III和2倍体积的无水乙醇（充分混匀），-20℃30min以上

12000rpm，4℃离心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤1～2次（振荡混匀）

12000rpm，4℃离心10min

室温风干

沉淀用20~100uLTE溶解，-200C保存第二部分凝胶电泳

1.

种类

1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易

2.

用途

琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。

3.

凝胶电泳的一般程序制胶点样电泳染色观察琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。二、实验原理

DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电；PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。影响迁移率的因素DNA分子的大小、DNA的构象、琼脂糖凝胶的浓度、所加电压、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。影响核酸电泳的因素：核酸的性质具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

Figure5.2aFigure5.19i.

分子量的大小:迁移距离与分子量的对数成反比ii. 凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNAiii. 电压:低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。DNA分子构象：超螺旋>线性>松弛环状常用染料EB:溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，E