基因工程原理与技术（第四版）课件 第3、4章 核酸分子的分离提取与酶处理、基因工程载体

第三章

核酸分子的分离提取与酶处理本章内容第一节核酸的分离纯化第二节DNA分子的酶切第三节DNA分子的链接第四节DNA分子的修饰第一节核酸的分离纯化核酸的分离纯化是获得目的基因及载体DNA片段的基本途径，核酸分离的好坏直接决定了核酸样品的质量。一、核酸分离提取的原则与要求核酸分离纯化总的原则是要保证核酸一级结构的完整性，防止降解，同时要排除其他分子的污染。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其他生物大分子，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。二、核酸提取的主要步骤1.样品准备新鲜的动植物组织材料，经清洗去掉非组织材料杂质。植物：液氮冻结，然后快速碾磨成粉末状；动物细胞：胰酶消化，再离心沉淀，收集细胞；微生物：离心沉淀收集菌体。二、核酸提取的主要步骤2.细胞破碎细胞的破碎有各种方法，包括物理方法、化学方法、酶法等。常见的物理方法有超声波法、均浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。缺点：容易导致DNA链的断裂。化学方法和酶法，如采用去污剂十二烷基硫酸钠(SDs)和溶菌酶或蛋白酶K，在Tris-HCl(pH8.0)的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中，温和裂解。DNA中RNA和RNA中DNA的去除。二、核酸提取的主要步骤3.分离纯化核酸核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，要将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步骤3.分离纯化核酸核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质，要将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。二、核酸提取的主要步骤4.核酸的沉淀浓缩常用的是乙醇沉淀法。加入1/10体积的乙酸钠(3mol/LpH=5.2)于DNA溶液中充分混匀；加入2.5倍体积预冷的乙醇，混合后，置于20℃中15~30min；12000rpm离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；加入离心管容量的75%乙醇，12000rpm离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；室温下，浆开盖的EP管的置于实验桌上5min，使残留的液体挥发至干；加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。三、质粒DNA的分离纯化1.碱裂解法碱裂解法是小量制备DNA较好的方法。原理：利用质粒DNA分子较小，且为超螺旋共价闭合环状的结构特点，它与分子较大的染色体DNA有很大差异。利用这种差异可以将它们分离，即在碱性pH(12~12.5)下，DNA分子均变性；恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性，就与其他成分共沉淀；而质粒DNA分子小且两条闭合环状分子即使变性也较紧密地缠绕在一起，准确复性而留于上清溶液中。三、质粒DNA的分离纯化1.碱裂解法碱裂解法是小量制备DNA较好的方法。原理：三、质粒DNA的分离纯化2.煮沸法沸法是利用加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却是即恢复期天然构象，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在于液相中，通过高速离（12000g）心将两者分开。然后可用5%CTAB选择性沉淀DNA。三、质粒DNA的分离纯化3.CsCl-EB密度梯度平衡离心CsCl是一种大分子量的重金属盐，长时间超速离心时，在管中形成1.0000-1.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。含有细胞裂解液的体系在长时间超速离心平衡后，DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡，染色体DNA、质粒、RNA以及蛋白质等不同浮力密度的物质可在管内不同位置形成区带。RNA可与Cs+结合，密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。三、质粒DNA的分离纯化3.CsCl-EB密度梯度平衡离心用含氯化铯和溴化乙锭的悬浮密度梯度离心法分离质粒和染色体DNA的方法，取决于与线状DNA和闭环DNA结合的溴化乙锭的量的差异。3.CsCl-EB密度梯度平衡离心（CsCldensity-gradientcentrifugation）三、质粒DNA的分离纯化根据质粒大小和结构与基因组DNA的区别，还可以采用阴离子交换色谱或分子筛色谱，还可以选用一些商业化的柱子，凝胶电泳也是一种分子不同分子量DNA的手段。三、质粒DNA的分离纯化4.DNA的纯化对于一些DNA纯化要求高的实如哺乳类动物细胞转染、转基因动物操作等，需要进一步提高质粒DNA的纯度。可采取以下方法：①CsCl梯度平衡超速离心法；②离子交换或凝胶过滤柱色谱法；③分级聚乙二醇沉淀法；④琼脂糖凝胶电泳片段分离法。四、基因组DNA的制备基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。可采取以下方法：①SDS法；②十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法；③其他，试剂盒。四、基因组DNA的制备五、RNA的提取RNA是目前发现的细胞内生物功能最丰富多样的生物大分子，同时也是DNA与蛋质信息传递的桥梁，因此完整RNA的提取和纯化是功能基因组时代的重要手段。如Northern杂交、mRNA分离、cDNA的合成及体外翻译都是以高质量RNA为基础。原核生物的rRNA分三类:5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四类:5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。真核生物的28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA。土壤宏转录组RNA的提取五、RNA的提取所有RNA的提取过程都有五个关键：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性解离，释放出RNA；③对RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。六、核酸的定量核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。常见的方法有紫外分光光度法及荧光分光光度法。六、核酸的定量1.紫外分光光度法核酸的最大吸收波长是260nm,10D值的光密度相当于双链DNA浓度为50

g/mL，单链DNA或RNA为40

g/mL，单链寡核苷酸为20

g/mL。通过测定在260nm和280m处的紫外吸收值的比值(OD260/OD280)来估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，若DNA样品的比值高于1.8，说明其中的RNA尚未除尽，比值小于1.8则说明残留酚或蛋白质。六、核酸的定量1.紫外分光光度法RNA的比值为2.0。当比值为1.8~2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的。当R<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。六、核酸的定量2.荧光分光光度法DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。六、核酸的定量2.荧光分光光度法DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。溴化乙锭（EB）SYBRGreenIGoldViewGelRed七、核酸的凝胶电泳电泳是利用带电荷物质在电场中迁移速率的不同将其分离的方法，而凝胶电泳利用了支持介质形成的网状结构使不同大小的大分子物质得以分离并保留于凝胶中，在不同位置形成条带。电泳迁移率的大小与物质的带电量与分子量的比值(荷质比)相关在中性pH值或碱性缓冲液中，核酸分子骨架上的磷酸基团在水中的解离带有负电荷，在电场中由负极向正极迁移。七、核酸的凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳不同浓度的琼脂糖凝胶电泳可分辨不同大小范围的DNA片段，对于双链DNA来说，DNA片段在500~60,000bp用琼脂糖凝胶分离。GeneRuler™100bpDNALadderPlus脉冲场电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis,PFGE)施加至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNA的目的，最大分辨率为5000kb大小的线性DNA分子。七、核酸的凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于DNA、蛋白质等的分离。核酸片段小于1000bp用聚丙烯酰胺凝胶，含高浓度尿素（7M）的变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离短的(<500bp)单链DNA或RNA。七、核酸的凝胶电泳3.凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化需将得到的含有目的基因的DNA片段以及提纯的质粒闭环DNA，再用合适的限制性内切酶分别把它们切开，用凝胶电泳把酶切后的不同片段分开，从凝胶中回收所需的目的基因片段和载体DNA的线性片段，并加以必需的纯化，特别是去除琼脂糖，排除其对DNA连接酶的抑制。七、核酸的凝胶电泳3.凝胶电泳分离后核酸片段的回收及纯化从琼脂糖凝胶中回收人们需要的DNA片段的方法有很多：电泳洗脱法、DEAE纤维素膜插片法、低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法、冻融法、玻璃奶法、QIAEX法。第二节DNA分子的酶切3用于基因转移的受体菌或细胞2用于基因克隆的载体1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要条件核酸酶是一类能够水解相邻两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，使核酸分子断裂的一类酶。核酸酶底物核糖核酸酶(RNase)，特异性水解断裂RNA链，如RnaseH脱氧核糖核酸酶(DNase)，专门水解断裂DNA链，如DNaseI核酸酶位置底物核糖核酸酶(RNase)，特异性水解断裂RNA链，如RnaseH脱氧核糖核酸酶(DNase)，专门水解断裂DNA链，如DNaseI核酸外切酶(exonuclease)，从核酸分子的末端开始，逐个消化降解多核苷酸链核酸内切酶(endonuclease)，从核酸分子的内部切割3′,5-磷酸二酯键，使核酸链断裂成更小的片段常用的工具酶：序号工具酶作用方式1限制性核酸内切酶切割DNA2DNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键3DNA聚合酶复制DNA4反转录酶cDNA合成5碱性磷酸酶切除末端磷酸基6多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记7DNaseI水解断裂DNA8RNaseH水解断裂RNA一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）限制性核酸内切酶是一类识别双链DNA内部特定核苷酸序列的DNA水解酶。它们以内切的方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现瑞士人Arber的团队采用放射性同位素标记发现，在噬菌体入侵宿主细胞时，进入细胞内的噬菌体DNA被降解掉，而宿主自身的DNA未被降解。因此，他们提出了限制-修饰(R-M)假说，认为细菌等一些原核生物体内存在一种可保护自身免于外来DNA(如噬菌体)侵入的防卫系统。限制修饰系统(restrictionmodificationsystem)该系统包括限制和修饰两个方面的作用。限制(restriction)是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修饰(modification)是指细菌的修饰酶对于自身DNA碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌限制酶的降解作用。寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的：1、修饰的甲基转移酶，2、核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的：1、修饰的甲基转移酶，2、核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰的作用：1、保护自身的DNA不受限制；2、破坏外源DNA使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的核酸内切限制酶，现在已成为重组DNA技术的重要工具酶。限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用1965年，Arber提出了生物体内存在具有切割基因功能的限制性内切酶。1968年成功分离出I型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970年，美国分子生物学家、遗传学家H.O.Smith分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学家D.Nathans使用II型限制性内切酶首次完成了对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现人工基因重组提供了有效的技术手段。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、限制性核酸内切酶的类型和命名限制性核酸内切酶的命名规则属名种名

株名HindI，HindII，

HindIIIHaemophilus

influenzae

d

嗜血流感杆菌d株（3）同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)（1）HindIII（2）EcoRⅠ一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列II型限制性内切酶一般能够识别4-8个脱氧核苷酸的序列。一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）2、II型限制性核酸内切酶的作用方式（1）识别并切割特异脱氧核苷酸序列（2）识别序列都是回文结构（3）切割后形成各种黏性末端或平末端粘性末端与平头末端互补性粘性末端之间碱基配对促使连接反应容易进行。平端之间连接反应效率很低，提高DNA连接酶和DNA片段浓度等措施可以使反应效率增强。粘性末端与平头末端特点由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在II型限制性内切酶是基因工程中主要的限制酶。二、限制性核酸内切酶切割DNA的方法

II

型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.510mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量MgCl2II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的双酶解：位置影响对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’共用位点相互干扰II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的双酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作酶切回收：0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥三、影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等（1）加大酶的用量，1mgDNA用10U酶（2）加大反应总体积（3）延长反应时间2.DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的Dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响

。

大肠杆菌中的Dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等A：B：3.核酸内切酶的缓冲液性质：缓冲液成分：氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。3.核酸内切酶的缓冲液性质：如：EcoRI在正常条件下识别并切割5’-GAATTC-3’序列，但在pH7.5变为8.5，甘油浓度超过5%（v/v），或用Mn2+代替Mg2+时，EcoRI识别序列变为

5’-AATT-3’。

这使得该酶在DNA分子上的切割位点数量增加，产物片段变短。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，例如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。4.酶切消化反应的温度DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。5.DNA的分子结构用UniversalBuffer和BasalBuffer进行限制酶活性表示甲基化对限制酶活性的影响DoubleDigestion（双酶切反应）和UniversalBuffer（通用缓冲液）的使用表用DNAman对DNA序列进行酶切位点分析单/双酶切举例二、实验程序：假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点,且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带,而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开三、结果与分析：M：DL2000marker1:重组质粒

第三节DNA分子的连接3用于基因转移的受体菌或细胞2用于基因克隆的载体1用于核酸操作的工具酶基因工程的必要条件DNA连接酶催化单链或双链DNA分子的连接修复，其作用位点位于DNA分子内或分子间相邻核苷酸的3′-羟基和5′-磷酸间形成共价的磷酸二酯键，使原先断裂的DNA连接起来。连接酶(ligase)是一类能将两个核酸片段连接起来的酶。一、连接酶根据连接酶来源：1.E.

coliDNA连接酶，大肠杆菌；2.T4DNA连接酶，T4噬菌体；3.热稳定DNA连接酶和T4RNA连接酶，T4噬菌体。连接酶种类DNA连接酶(DNAligase)借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相邻的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键，在基因工程中用来将不同来源DNA链进行连接，形成重组DNA。在基因工程中常用到的DNA连接酶主要是E.

coli

DNA连接酶和T4DNA连接酶。一、连接酶T4DNA连接酶可催化DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA黏性末端或平末端之间的连接反应。连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃。T4DNA连接酶T4DNA连接酶与大肠杆菌连接酶相比在基因工程中的应用更方便一些，主要用于：①修复双链DNA上的单链缺口(与大肠杆菌DNA连接酶相同)，这是两种DNA连接酶都具有的基本活性；②连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，前者反应速度较快；③连接两个平末端双链DNA分子。T4DNA连接酶二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；黏性末端二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；第三类是多聚脱氧核苷酸接尾连接，用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA片段加上多聚脱氧核苷酸尾后，再用DNA连接酶将它们连接起来；二、DNA片段之间的连接DNA片段之间的连接可分为四类方法：第一类是黏性末端DNA片段的连接，用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；第二类是平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；第三类是多聚脱氧核苷酸接尾连接，用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端DNA片段加上多聚脱氧核苷酸尾后，再用DNA连接酶将它们连接起来；第四类是接头连接，在平端DNA片段末端加上化学合成的接头(

linker)而形成黏性末端，再用DNA连接酶将各黏性末端DNA片段连接起来。三、平末端DNA片段的连接1.平末端DNA片段的直接连接，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来；2.同聚物加尾法，利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能，可以在DNA分子3’-OH端连续添加一系列的核苷酸，如polyA或polyT；3.接头连接，在平端DNA片段末端加上化学合成的接头(

linker)而形成黏性末端，再用DNA连接酶将各黏性末端DNA片段连接起来。四、影响连接反应的因素很多因素都会影响到连接反应的效率，主要包括：（1）温度，T4DNA连接酶最适温度是37℃，室温25℃，16℃或4℃过夜；（2）DNA末端的性质，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和浓度，DNA片段的摩尔比为1:3

~1:10；四、影响连接反应的因素很多因素都会影响到连接反应的效率，主要包括：（1）温度，T4DNA连接酶最适温度是37℃，室温25℃，16℃或4℃过夜；（2）DNA末端的性质，平末端，粘性末端；（3）DNA片段的大小和浓度，DNA片段的摩尔比为1:3

~1:10；（4）离子浓度，Mg2+、ATP等，Ligasebuffer。DNA连接酶2.DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlLT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第四节DNA分子的修饰第四节DNA分子的修饰DNA修饰酶类有：1、末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT），又称末端转移酶2、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）3、T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase，T4PNK）1、末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT），又称末端转移酶末端转移酶是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，来源于小牛胸腺，分子质量为60kDa。此酶催化脱氧核苷酸加入到DNA的3′-OH末端，并伴随无机磷酸的释放。当反应混合物中只有同种dNTP时，该酶可以催化形成仅由一种核苷酸组成的3尾巴，这种尾巴称为同聚物尾巴（homopolymerictail）。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的应用（1）DNA末端加尾(DNAtailing)。在cDNA末端的快速扩增(RACE)中，来添加“核苷酸(nucleotide)，然后可以用来作为在后续PCR的“引物”(primer)的模板；（2）寡核苷酸或DNA3‘羟基末端标记。添加标记放射性同位素的核苷酸至DNA末端，用于探针制备、细胞凋亡等。2、碱性磷酸酶对DNA的修饰作用碱性磷酸酶能催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5′-磷酸基，即脱磷酸作用。在基因工程中常用碱性磷酸酶处理限制性内切酶切割后的载体DNA，防止载体自连。制备5’末端标记探针时，预先除去探针的5’末端磷酸根，可提高由激酶利用γ-32P-ATP添加标记磷酸根的效率。3、T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase，T4PNK）T4多聚核苷酸激酶是一种多聚核苷酸5-OH激酶，具有两种活性：（1）正向反应活性的效率高，即：催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5′-OH，可用来标记或磷酸化核酸分子的5′-端。（2）逆向反应是交换反应，活性很低，催化5-磷酸的交换。反应式为：DNA-5′-OH+ATP(或NTP)→DNA-5’-P+ADP(或NDP)

在过量ADP存在下，T4多聚核苷酸激酶催化DNA的5’-磷酸转移给ADP，然后DNA从γ-32PATP中获得放射性标记的γ-磷酸而被重新磷酸化。T4多聚核苷酸激酶的应用①使DNA或RNA的5′-OH磷酸化，保证随后进行的连接反应正常进行；②利用其催化ATP上的γ-磷酸（γ-32PATP）转移至DNA或RNA的5′-OH上用作Southern、Northern、EMSA等试验的探针，凝胶电泳的Marker，DNA测序引物，以及PCR引物等；③催化3′-磷酸化的单核苷酸进行5′-OH的磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3-末端连接。

感谢聆听第四章基因工程的载体本章内容第一节质粒载体第二节噬菌体载体第三节酵母载体第四节Ti质粒表达载体第五节病毒表达载体第六节人工染色体载体携带外源基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的运载工具称之为载体(

vector)，其本质是DNA(少数为RNA)，如质粒DNA、病毒DNA、cos质粒等载体。①在宿主细胞中能自我复制，即本身是复制子；②容易从宿主细胞中分离纯化；③载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域、插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；④有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装；⑤能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；⑥用于表达目的基因的载体还应具有启动子(强启动子)、增强子、SD序列、终止子等表达元件。基因工程应用的载体通常需具有如下特性：克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段，有一个松弛的复制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。

克隆载体可分为：质粒载体(plasmidvector)、噬菌体载体(phagevector)、人工染色体(artificialchromosome)等。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，才能使外源基因在宿主细胞中有效地表达。载体按功能可分为克隆载体和表达载体两种基本类型：第一节质粒载体质粒的构建分子量大、拷贝数低、酶切位点少、遗传标记不理想，不能满足克隆载体的要求。需要进行人工构建。几种野生型质粒：pSC1018.8kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20–30，大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因Apr天然质粒的缺陷：一、质粒的一般生物学特征质粒的概念定义：质粒(

plasmid)是存在于细胞质中的一类独立于染色体的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状DNA(covalent

closed

circular

DNA，cccDNA)，少数是线性。存在：质粒不仅仅存在于原核生物中，也存在于真核生物及其细胞器中。核酸类型：绝大多数的质粒是DNA型的。大小：质粒DNA的分子量范围：1-300kb。一、质粒的一般生物学特征2.质粒DNA的构型①如果两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，通常呈现超螺旋构型(supercoiledDNA，SCDNA)；②如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(opencirclesDNA，OCDNA)，此即OC构型；③若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子(linearDNA，LDNA)，通称L构型。一、质粒的一般生物学特征2.质粒DNA的构型一、质粒的一般生物学特征3.质粒DNA的复制质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型(stringentcontrol)：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。松弛控制型(relaxedcontrol)：松弛型质粒是一种高拷贝数质粒，在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，甚至多达数百个。如ColE1质粒。通常小质粒为松弛型质粒，大质粒为严紧型质粒。质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRepVectorsCopyNumberoripUC~500-700pMB1(derivative)pBR322~15-20pMB1pET~15-20pBR322pGEX~15-20pBR322pColE1~15-20ColE1pR6K~15-20R6KpACYC~10p15ApSC101~5pSC101pBluescript~300-500ColE1(derivative)andF1pGEM~300-500pUCandF1常见质粒载体拷贝数及其复制子一、质粒的一般生物学特征4.质粒的不相容性（不亲和性）含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容含有相似复制子结构的质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的控制，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。质粒的不相容性的分子机制：一、质粒的一般生物学特征5.质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用，如

ColE1非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。一、质粒的一般生物学特征6.携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义一、质粒的一般生物学特征7.质粒的命名原则新发现或改造的质粒命名第1个小写字母p表示质粒(plasmid)，后面2个或3个大写字母表示构建该质粒的研究人员的姓名或实验室名称，最后的数字表示构建的一系列质粒的编号。pBR322plasmidF.BoliverR.L.RodriguezLabNo.二、理想质粒载体的必备条件(1)具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子，另一个为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。(2)带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。多克隆位点(multiplecloningsite，MCS)。(3)具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的遗传表型特征。常用的选择标记基因主要是抗生素的抗性基因和

-半乳糖苷酶基因。(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数。(5)基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因，拷贝数100-1000，扩增基因低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20表3-1

：质粒载体及其拷贝数质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因，拷贝数100-1000，扩增基因低拷贝质粒来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件三、常用的质粒载体

1977年，加州大学旧金山分校的F.Bolivar和R.L.Rodriguez构建了一个典型的用于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的。pBR322质粒DNA分子的大小为4363bp。具有ColEI松弛型复制子，在每个E.coli细胞中维持约20个拷贝。含有选择标记基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）。1.pBR322质粒载体大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图pMB1pSF2124pSC101pBR322质粒载体具有如下优点：①具有较小的分子量。pBR322质粒DNA分子的长度是4363bp，这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段(一般可接受小于6kb的外源DNA)。②具有两种抗生素抗性基因（tetr,ampr），供作转化子的选择记号。可以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。③具有较高的拷贝数。经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这为重组体DNA的制备提供了极大的方便。三、常用的质粒载体

1983年，美国UniversityofMinnesota的科学家JanNorrander,TomasKempe和JoachimMessing在pBR322质粒框架基础上构建的一种广泛使用的新型质粒载体即pUC系列质粒载体pUC18/19。2.pUC质粒载体pUC18/19：拷贝数500-700/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记

lacZ’重要的大肠杆菌质粒载体pUC系列质粒载体通常包括以下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点(ori)，pUC质粒缺乏rop基因，在正常情况下，该基因紧靠DNA复制起点，与控制拷贝数有关。缺乏rop基因的结果是，这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或CoEl)复制起点的质粒高得多。因而在细菌培养物中无须加入氯霉素来提高其拷贝数。②氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶切割位点。③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列。pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段a

X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷宿主细胞pUC18/19PlaclacZMCSa-肽a

X-gal目的基因宿主细胞正选择标记lacZ’的显色原理（a-互补作用）？？？？pUC系列质粒载体通常包括以下四个组成部分：①来自pBR322质粒的复制起点(ori)，pUC质粒缺乏rop基因，在正常情况下，该基因紧靠DNA复制起点，与控制拷贝数有关。缺乏rop基因的结果是，这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或CoEl)复制起点的质粒高得多。因而在细菌培养物中无须加入氯霉素来提高其拷贝数。②氨苄青霉素抗性基因(ampr)，但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制性核酸内切酶切割位点。③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码a-肽链的DNA序列。④位于lacZ基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点(MCS)区段，但它的存在并不破坏该基因的功能。MCS是含有多种限制酶的单识别位点的一段核苷酸序列，便于外源基因的插入MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。pUC质粒载体的优点有三个主要方面：①具有更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多，如pUC18为2686bp。Rop蛋白质的缺失使得pUC质粒的拷贝为500~700个。②适用于组织化学方法检测重组体。pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的a肽链可参与a-互补作用。因此，可用X-gal显色的组织化学方法步实现对重组体转化子克隆的鉴定，从而节省时间。③具有MCS区段。pGEM-3Zf(+)多拷贝（~300-500）装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱裂解法质粒DNA纯度低、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒DNA的分离纯化1、氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜（16-48h）在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs质粒DNA的分离纯化2、碱裂解法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNA质粒DNA的分离纯化3、沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA质粒DNA的分离纯化4、试剂盒Kit质粒DNA的分离纯化Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能在PCR扩增产物的3`-端自动添加一个3`-A突出末端利用这个原理，制造有5`-端单个T碱基的载体在连接酶作用下，PCR产物3`-A和T载体的5`-T碱基互补配对形成TA克隆T-A克隆载体T-A克隆载体TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理不需在PCR扩增产物上加接头可直接进行克隆。T-A克隆优点第二节噬菌体载体噬菌体噬菌体（bacteriophage，简称phage）是一类细菌病毒的总称。它是一类非细胞微生物，能高效率高特异性侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体M13phage

phage噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链RNA等多种形式。噬菌体噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差可达上百倍。不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，可分为三种类型。大多数噬菌体是具尾部结构的二十面体，头部下端连接着一条尾部结构，看起来像是一种小型的皮下注射器，如T4噬菌体。另两种类型是无尾部结构的二十面体型和线状体型。噬菌体噬菌体M13phage

phage噬菌体噬菌体或病毒载体特性：高效率的感染性——使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性——使外源基因在受体细胞中高效扩增

噬菌体生物学特性：感染周期

噬菌体生物学特性：溶菌周期和溶源周期在溶菌周期中，噬菌体DNA注入细菌细胞后，噬菌体DNA大量复制，并合成出新的头部和尾部蛋白质，头部蛋白质组装成头部，并把噬菌体的DNA包裹在内，然后再同尾部蛋白质连接起来，形成子代噬菌体颗粒，最后噬菌体产生出一种特异性的酶，破坏细菌细胞壁，子代噬菌体颗粒释放出来，细菌裂解死亡，这种具有溶菌周期的噬菌体被称为烈性噬菌体（virulentphage）。在溶源周期中，噬菌体的DNA进入细菌细胞后，并不马上进行复制，而是在特定的位点整合到宿主染色体中，成为染色体的一个组成部分，随细菌染色体的复制而复制，并分配到子细胞中而不会出现子代噬菌体颗粒。但是，这种潜伏的噬菌体DNA在某种营养条件或环境条件的胁迫下，可从宿主染色体DNA上切割下来，并进入溶菌周期，细菌同样也会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌体颗粒。把这种既进入溶菌周期又能进入溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体(temperatephage)，又称溶原性噬菌体（lysogenicphage）。

噬菌体生物学特性：溶菌周期和溶源周期溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）二、λ噬菌体载体λ噬菌体载体（lambdaphagevector）是最早使用的克隆载体之一，也是迄今为止研究的最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，在重组DNA的研究中有着相当广泛的应用。二、λ噬菌体载体λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。由DNA（λDNA）和外壳蛋白质组成。外形特征类似于蝌蚪，由头和尾组成。1.λ噬菌体载体的生物学特性λ噬菌体DNA是一条线性双链DNA分子，长度为48502bp。在其两端的5

末端各带有一个长为12个碱基（序列为5-GGGCGGCGACCT-3

）的单链互补黏性末端。一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环状DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesiveendsite）。随后环状DNA的两切口在宿主细胞的DNA连接酶和促旋酶的作用下，形成封闭的环状双链，充当转录的模板。二、λ噬菌体载体λ噬菌体DNA分子的cos位点

l噬菌体基因组DNA上至少有61个基因，其中有一般左右参与了噬菌体生命周期活动，这类基因称为l噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，这类基因称为非必需基因。二、λ噬菌体载体5’GGGCGGCGACCTG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA重组区调控区头部区尾部区

噬菌体生物学特性：生物结构λgtWESλB噬菌体载体的构建

l噬菌体基因组DNA上至少有61个基因，其中有一般左右参与了噬菌体生命周期活动，这类基因称为l噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能，这类基因称为非必需基因。

噬菌体具有溶菌周期和溶源周期两种生长途径。二、λ噬菌体载体前噬菌体（pre-phage）大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：

溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态噬菌体二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建在基因工程中，λ噬菌体载体是最主要的一种载体。然而野生型的λ噬菌体并不适于直接用作基因克隆的载体，一方面λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有多个基因克隆常用的限制酶识别位点（如5个BamH

I位点、6个BglⅡ位点和5个EcoR

I位点等）；另一方面λ噬菌体外壳只能接纳相当于基因组大小的75％～105％的DNA分子。二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建对野生型的λ噬菌体的改造主要包括以下几个方面：（1）去除λDNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。这是改造λDNA的首要目标。为此，可以删除λ噬菌体的非必需区，使λ噬菌体载体可插入5～20kb的外源DNA片段，而不影响其感染力。（2）去除多余的限制酶切割位点，确定1～2个单酶切位点作为克隆位点。因此，在构建克隆载体时，对于某种限制性内切酶来说，只能保留1～2个单酶切位点作为克隆位点，用于插入或替换外源DNA片段，而必需区内的这种酶的识别序列必须用点突变或甲基化酶处理等方法使之失效。二、λ噬菌体载体2.λ噬菌体载体的构建对野生型的λ噬菌体的改造主要包括以下几个方面：（3）λDNA的非必需区装入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。在λ噬菌体载体中主要利用λ噬菌体的生物学特性来做选择标记。主要有cI基因失活、Spi筛选、lacZ基因失活。（4）建立重组的λDNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。λ噬菌体改造成为基因工程中用的载体，目的是把外源DNA片段插入载体中，并使它导入受体细胞。这种由寄主细胞捕获噬菌体（病毒）DNA的过程为转染。若以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的过程，特称为转导。而将质粒等外源DNA制剂引入细胞的过程，称为转化。二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类随着体外包装技术和寡聚核苷酸合成技术的发展，人们已经构建了许多λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：插入型载体（insertionvector）和置换型载体（replacementvector）。二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类（1）插入型载体通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度---插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：6

-11

kb噬菌体二、λ噬菌体载体3.λ噬菌体载体种类（1）插入型载体，通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertionvectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。（2）置换型载体，允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体，称为置换型载体，又称取代型载体（subtitutionvectors）。大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度---取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb噬菌体二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmidvector）是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体，也称为粘粒载体，即由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成。借用cos-（粘性尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称cosmid。柯斯质粒是1978年J．Coffins及B．Hohn等人发明的，比λ噬菌体具有更大的克隆能力，在真核基因的克隆中起到了巨大的作用。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（1）柯斯质粒载体的构成柯斯质粒载体是一种环状双链DNA分子，大小为4～6kb。它由4部分组成，包括质粒的复制起点、一个或多个限制性核酸内切酶的单一切割位点、抗性标记基因和λ噬菌体的黏性末端片段。柯斯质粒载体pHC79的结构图pHC79(6kb)二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。由于柯斯质粒载体不含λ噬菌体裂解生长、溶源性途径和DNA复制系统，所以不会产生子代噬菌体。但是，此载体含有一个cos位点，在A蛋白的作用下，cos位点被切开，提供体外包装必需的cos末端。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。进入宿主细胞之后的柯斯质粒DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于柯斯质粒载体不含有入噬菌体的全部必要基因，因此它不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在宿主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗生素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记，其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子一般只有5~7kb。按λ噬菌体的包装限制(38~52kb)，可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成为噬菌体颗粒的最大外源DNA片段可达45kb左右。同时，由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还存在着一个最低极限值。如果柯斯质粒载体自身大小为5kb，那么插入的外源DNA片段至少得有33kb，才能包装形成具有感染性的噬菌体颗粒。由此可见，柯斯质粒载体适于克隆大片段的DNA分子。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。柯斯质粒载体能与共存于同一寄主细胞中的带有共同序列的质粒进行重组，形成共合体。当一个柯斯质粒载体与带有不同抗生素标记的质粒转化同一宿主细胞时，便可筛选到具有相容性复制起点的共合体分子。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（2）柯斯质粒载体的特点目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体。柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。二、λ噬菌体载体4.柯斯质粒载体（3）柯斯质粒载体进行基因克隆的基本程序M13噬菌体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13噬菌体M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13噬菌体DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响其复制，这为构建克隆载体提供了条件。M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染F+的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，但抑制宿主细胞的生长。M13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ’polylinkerM13噬菌体大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用。M13重组分子筛选简便。被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。噬菌体可以克隆双链DNA分子中的每一条链。可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒，同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC