黄瓜枯萎病菌拮抗放线菌的筛选

黄瓜枯萎病菌拮抗放线菌的筛选

黄瓜萎缩是由头孢菌属的黄瓜专化型引起的对黄瓜植物维管束的侵犯引起的。近年来黄瓜枯萎病的发生加重,一般可导致黄瓜产量减少10%~20%,严重时达30%以上(祁之秋等,2009)。生物农药具有高效,对环境友好,不易产生抗药性等优点越来越受到重视(Ansarietal.,2012)。放线菌(Actinomycetes)是一类具有重要价值的微生物,易产生抗病原菌成分等生物活性物质,已成为生物农药开发的主要来源(Loqmanetal.,2009;Shimizuetal.,2009)。同时放线菌作为生防菌也可促进作物生长和产量提高(Berg,2009;Nimnoietal.,2010;王桂莲等,2011)。本研究中以从浙江西溪湿地、山东盐碱地、山东胜利油田、黄河下游河床及海南岛沙地等不同生态环境采集的土样作为筛选放线菌样本,筛选出多株对黄瓜枯萎病病原菌具有良好拮抗作用的放线菌,对其中一株高效菌株XF-7进行了分类鉴定,并研究了其发酵液对黄瓜枯萎病菌孢子萌发、菌丝生长、黄瓜种子发芽的影响及对苗期枯萎病的生防效果。1材料和方法1.1菌株和培养基供试病原菌:黄瓜枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、黄瓜立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)由中国计量学院生物安全与食品科学研究所保藏。培养基:高氏一号培养基用于放线菌的分离;PDA、PD培养基用于拮抗放线菌的筛选和培养;发酵培养基:含马铃薯200(g·L-1),葡萄糖20,NaCl0.5,KNO31,MgSO40.5,K2HPO40.5。土样:所筛菌株的土样为2010年8—10月于浙江西溪湿地、山东盐碱地、山东胜利油田、黄河下游河床及海南岛沙地采集。采样过程为去掉表层土,采集深度为10~15cm的土样。1.2抑菌活性测定将采集的土样采用平板稀释法分离放线菌,分离培养基中加入20μg·mL-1重铬酸钾。将长出的放线菌分别点种于混有黄瓜枯萎病原菌孢子悬液(1×106cfu·mL-1)的PDA平板上,通过观察抑菌圈大小,挑选抑菌圈较明显的菌株进入复筛。复筛采用平板对峙法(方中达,1998)对初筛的放线菌进行抑菌活性测定,重复3次。根据结果确定抑菌活性最强的菌株。抑菌率(%)=(1–处理菌落生长半径/对照菌落生长半径)×100。1.3菌落生长抑制试验将XF-7接种到发酵培养基中,28℃、180r·min-1摇床培养96h后,7800r·min-1离心7min,再用滤纸过滤得发酵滤液。如果用于菌丝生长抑制试验,还需用孔径0.22µm微孔滤膜过滤除菌。将制得的发酵滤液稀释成2-1~2-7的浓度梯度,然后按1︰9的比例混入50℃的PDA培养基中制备平板,同时设加无菌水的对照。平板凝固后在中央接种直径4mm的黄瓜枯萎病原菌的菌饼。待对照菌落直径长至平板直径的2/3左右时统计结果。每处理重复3次。采用十字交叉法,测定菌落的直径。菌丝生长抑制率(%)=[(对照菌落直径–处理菌落直径)/(对照菌落直径–4)]×100。1.4发酵滤液处理将发酵滤液稀释成2-1~2-9的浓度梯度,取病原菌孢子悬浮液25μL滴加到凹玻片上再分别滴加不同浓度的发酵滤液25μL,每处理重复3次,以加无菌水的作对照。于室温(28℃)保湿条件下培养,24h后观察病原菌孢子生长情况并统计孢子萌发抑制率。1.5制备放线菌xf-7的发酵滤液挑选饱满均匀的黄瓜种子,用3%次氯酸钠消毒10min,无菌水洗净,25℃下催芽24h后备用。制备放线菌XF-7的发酵滤液。将黄瓜种子在菌株XF-7发酵滤液中浸泡30min,置于培养皿中的灭菌滤纸上,25℃培养48h,计算黄瓜种子的发芽率,测量胚芽、胚根长度。以无菌水浸泡的黄瓜种子为对照。每次处理30粒,3次重复。具体参照张璐等(2010)的方法。1.6黄瓜苗病病原菌发病情况预防试验:在钵栽黄瓜长出两片真叶时做如下处理。(1)用XF-7的发酵滤液灌根25mL;(2)清水灌根25mL作为阴性对照;(3)30%乙蒜素1000倍稀释液灌根25mL作为阳性对照。2d后采用根部切伤接种法接种黄瓜枯萎病病原菌(方中达,1998),于灌药后7、14和21d统计预防效果。治疗试验:先对黄瓜幼苗接种枯萎病病原菌,在接种病原菌7d后做如下处理:(1)用XF-7的发酵滤液灌根25mL;(2)清水灌根25mL做为阴性对照;(3)30%乙蒜素1000倍稀释液灌根25mL,作为阳性对照。再过7d第1次统计病情指数,14d第2次统计病情指数,21d第3次统计病情指数。分别在第1次和第2次病情统计结束后及时进行第2次和第3次灌根处理。每处理10钵,3次重复。按时统计幼苗发病情况。按病情分级,计算病情指数和防效(苗则彦等,2009)。病情指数=[∑(各级病株数×对应各级值)/(调查总株数×发病最高级值)]×100。相对防效(%)=[(对照病情指数–处理病情指数)/对照病情指数]×100。1.7dna提取、纯化及测序菌体形态和菌落形状观察参照周德庆(2002)的方法;菌株生理生化反应参照中国科学院微生物研究所放线菌分类组(1975)及Buchanan和Gibbons(1984)的方法。菌株经PD培养基28℃下振荡培养至对数生长期时,8000r·min-1离心2min,收集菌体。参照Sambrook&Russell(2001)的方法提取放线菌基因组DNA。PCR所用正向引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物为1495R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR扩增体系为(50μL):PCRReactionMix25μL,引物F(100μmol·L-1)1μL,引物R(100μmol·L-1)1μL,模板DNA(10ng·μL-1)1μL,TaqDNA聚合酶(5U·μL-1)1μL,ddH2O21μL。95℃预变性5min;94℃变性1min,56℃退火45s,72℃延伸1.5min,30个循环;72℃延伸10min。PCR纯化产物提交上海桑尼生物科技有限公司测序。将测得的16SrDNA序列输入GenBank,应用Blast软件进行同源性搜索,并用MEGA4软件进行同源性比较,采用Bootstrap构建系统发育树。2结果与分析2.1平板对称试验从土壤中共分离到放线菌315株,其中对黄瓜枯萎病菌有拮抗作用的44株。图1左图显示的是筛选方法,通过点种,观察抑菌圈大小来筛选拮抗菌株。图1右图A为所筛出的效果较好的拮抗放线菌的平板对峙效果,所圈菌株为XF-7;B为同时接种的黄瓜枯萎病原菌对照。比较A和B可以看出通过此方法筛出的拮抗放线菌有较好的抑菌效果。平板对峙试验结果如表1显示,DC-1、XF-7、H-22对黄瓜枯萎病原菌的抑制效果较好。又同时观察了这几株病原菌对黄瓜立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)和水稻纹枯病原菌(R.solani)的抑菌效果,综合比较发现菌株XF-7对3种病原菌的拮抗作用均最为明显,因此选择XF-7作为后续试验的菌株。2.2倍时抑制率XF-7的发酵滤液对黄瓜枯萎病原菌菌丝生长有明显的抑制作用,由图2可以看出,稀释10倍的发酵液,能完全抑制黄瓜枯萎病原菌的菌丝生长,稀释20倍时抑制率仍在80%以上。菌株XF-7发酵液能强烈抑制黄瓜枯萎病菌孢子的萌发,用其处理24h后,黄瓜枯萎病菌孢子没有发生任何萌发(图3,A);用清水处理24h后,黄瓜枯萎病菌孢子能萌发成菌丝体(图3,B)。由图4可以看到,当XF-7的发酵液稀释到32倍时,对黄瓜枯萎病原菌的孢子萌发抑制率仍在99%以上,表明XF-7的发酵代谢产物能强烈抑制黄瓜枯萎病原菌孢子的萌发。2.3发酵液对子发芽率的影响从表2中可以看出,与对照相比,菌株XF-7的发酵液对黄瓜种子的萌发没有负面影响。经XF-7发酵液处理的种子发芽率与对照并无显著性差异,但胚芽长度与胚根长度大于对照,说明XF-7发酵液有一定的促生作用。表3显示,菌株XF-7的发酵液对黄瓜枯萎病的预防效果和治疗效果,7d时分别为96.93%和95.80%,14d时为90.33%和89.93%,预防效果好于治疗效果,而且与常规的30%乙蒜素杀菌剂的效果并无显著性差异。2.4xf-7抗阳性放线菌的鉴定2.4.1菌株的形态特性菌株XF-7的气生菌丝在高氏一号培养基上初为白色,3d后变为淡粉色,在光学显微镜下观察气生菌丝呈长直或波曲状,多分支;基内菌丝无横隔,不断裂。孢子丝呈长直形,成熟的孢子成串珠状,孢子在电子显微镜下的形态如图5。孢子表面光滑并呈柱状。将菌株XF-7接种在不同的培养基上,其形态特征变化较大(表4),在葡萄糖天门冬素琼脂培养基上的菌落形态类似细菌,且不产生气生菌丝,而在高氏一号和淀粉琼脂培养基上生长非常好,在上述这些培养基上不产生色素。生理生化特性:菌株XF-7能使明胶液化,牛奶凝固并胨化,淀粉水解;在纤维素上不生长;可产生H2S;能利用葡萄糖、果糖、甘露醇,不能利用木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、棉籽糖、肌醇及蔗糖。菌株XF-7在不同培养基上的形态特征分析,对照《链霉菌鉴定手册》(中国科学院微生物研究所放线菌分类组,1975)可将该菌株初步鉴定为链霉菌粉红孢Roseosporus类群中的玫瑰Roseus亚群。根据菌株的生理生化特性,参照《伯杰细菌鉴定手册》(Buchanan&Gibbons,1984),发现与毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)极为相似。2.4.2srrna的亲缘关系以菌株XF-7的基因组为模板,经PCR扩增,结果如图6。菌株XF-7获得大小约1.5kb的特异性片段,采用双向测定法测得菌株XF-7的16SrDNA序列全长为1416bp,GenBank中的序列登录号为JN315670。经Blast同源序列检索发现,在16SrDNA亲缘关系相近前50个序列中,全部为链霉菌属菌株,XF-7与它们均有较高的同源性,其中与毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)的同源性最高,达100%。选取11个典型菌株的16SrDNA序列用MEGA4软件进行系统进化分析,结果如图7。菌株XF-7与毒三素链霉菌(S.toxytricini)单独构成一个分支,反映出两者的亲缘关系最近。结合形态和生理生化特性,最终将菌株命名为StreptomycestoxytriciniXF-7。3抗混养菌株的筛选有研究表明植物提取物中的活性成分对黄瓜枯萎病原菌有一定的抑制作用,但植物有效成分提取操作步骤多,效率低(马丽娟等,2008;郎剑锋等,2009)。目前报道较多的仍是以筛选拮抗微生物为主要手段防治病害的发生。张璐等(2010)从植物根系土壤中筛选到芽孢杆菌DS-1对黄瓜枯萎病原菌有显著的生防效果。宋以星等(2011)从蔬菜种植区筛选出一株对黄瓜枯萎病病原菌有强烈抑制作用的芽孢杆菌B1。拮抗放线菌的筛选已经成为生物防治植物病害的重要措施之一(何建清等,2010;秦涵淳等,2010)。目前拮抗放线菌的筛选一般是在分离得到放线菌经纯培养后,采用平板对峙法测定每个菌株的拮抗活性。这种方法工作量大,耗时耗力,且效果并不显著(安德荣等,2002;潘荣光和刘明霞,2008)。本研究中尝试了采用混有黄瓜枯萎病原菌孢子悬液的平板作为指示平板,在筛选出放线菌后通过观察指示平板上抑菌圈的大小,直接筛选出具有明显拮抗活性的放线菌,再进行纯培养。试验证明此筛选方法较为简便,效率较高,菌株XF-7正是利用该方法筛选到的一株高效菌株。经16SrDNA序列分析鉴定发现,XF-7与毒三素链霉菌(Streptomycestoxytricini)的同源性达100%,与生理生化鉴定结果相吻合,最终将其命名为StreptomycestoxytriciniXF-7。S.toxytricini是利普司他