福建宁德地区茶叶内生菌的分离及脂肪酸鉴定

福建宁德地区茶叶内生菌的分离及脂肪酸鉴定

1898年，vol从黑麦草的种子中分离出第一株生物性植物，并将生物性植物作为新的微生物资源加以关注。在植物体内，内菌具有独立的分布、繁殖和传播的特点，可以成为评价病虫害的微生物和变贫的植物。因此，对提高农业生产力和内菌的利用，可以控制作物病虫害，发展有利于生物化学的内菌，对促进作物产量和品质具有重要意义。从中国来到棉花、水稻、马蹄、番茄、胡椒等植物。结果表明，内菌对黄豆碱、番茄紫腐病、番茄绿枯萎病、青椒糖菌等植物疾病有防止作用，对植物有高产效果。目前,在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过120种(隶属于54个属).这些内生细菌大多为土壤微生物种类,其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Eterobacter)以及土壤杆菌属(Agrobacterium)为最常见的属.脂肪酸是生物体内不可缺少的能量和营养物质,是生物体的基本结构成分之一,脂肪酸和细菌的遗传变异、毒力、耐药性等关系密切.细菌细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌DNA具有高度的同源性,各种细菌均具有特征性的细胞脂肪酸指纹图谱.国内外已有把脂肪酸用于细菌鉴定的报道.福建省是茶叶种植和生产大省,全省共有茶园面积14.5万公顷,居全国第3位,因此开发茶叶内生菌作为生防制剂有着良好的发展前景.本研究从茶叶上分离内生菌,利用脂肪酸进行鉴定,以筛选具有广谱抑菌活性的内生细菌应用于植物病害的生物防治.1材料和方法1.1供试病原菌及其来源茶叶样本于2006年3月采自福建省福鼎市品品香茶业有限公司和福安市天香茶叶有限公司的有机茶生产基地和加工厂,茶树品种为大白毫和福云六号,种植方式分为有机种植和常规种植,叶分为老叶和芽叶,加工工艺分为杀青和未杀青.样本采回实验室后24h内进行微生物的分离.供试病原菌及其来源见表1.1.2内生细菌、真菌和放线菌的分离纯化细菌分离与增殖培养均采用NA培养基,真菌培养与拮抗测定均采用PDA培养基,放线菌分离采用高氏一号培养基.分别称取适量茶叶样品,冲洗干净后吸去水分,用75%乙醇浸30-40s,再转入10%次氯酸钠溶液中浸5min,无菌水漂洗数次,无菌滤纸吸干.用无菌剪刀剪碎样品于无菌研钵中,充分研磨匀浆,用无菌水以10-3、10-4、10-5梯度稀释,各取100μL稀释液涂布于不同培养基进行内生细菌、真菌和放线菌的分离,重复3次.根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征判断分离出的菌落种类并计数.按常规方法挑取单菌落纯化后保存,供测试鉴定.1.3茶叶中的生细菌脂肪酸1.3.1试剂的配制方法①细菌培养条件:TSBA平板培养基[30g胰蛋白胨大豆肉汤(TSB,购于Fisher公司)+15g琼脂+1L水],四线划线法,培养温度(28±1)℃,培养时间(24±2)h.②获菌:用接种环挑取3-5环(湿重约40mg)菌落置入干净、干燥有螺旋盖的试管中(最佳获菌区域为第3区).③皂化:加入(1.0±0.1)mL皂化试剂(45gNaOH+150mL甲醇+150mL水),拧紧盖子,振荡5-10s,放入95-100℃沸水中5min,室温冷却,振荡5-10s,再水浴25min,室温冷却.④甲基化:开盖加入(2.0±0.1)mL甲基化试剂(325mL6mol·L-1盐酸+275mL甲醇),拧紧盖子,振荡5-10s,(80±1)℃水浴10min,移开且快速用流动自来水冷却至室温.⑤萃取:加入(1.25±0.1)mL萃取试剂(200mL正已烷+200mL甲基叔丁基乙醚),拧紧盖子,温和混合旋转10min,打开管盖,利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部分.⑥基本洗涤:加入(3.0±0.2)mL洗涤试剂(10.8gNaOH+900mL水),拧紧盖子,温和混合旋转5min,打开管盖,利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶,用于气相检测.上述试剂配制方法由MIDI公司提供.1.3.2脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本的制备细菌脂肪酸成分检测采用美国Agilent6890N型气相色谱系统,包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器;通过细菌细胞脂肪酸成分进行细菌鉴定的分析软件采用SherlockMIS4.5(MicrobialIdentificationSystem)和LGS4.5(LibraryGenerationSoftware)(均为美国MIDI公司产品).在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本:二阶程序升高柱温,170℃起始,每分钟升温5℃升至260℃,而后再每分钟升温40℃升至310℃,维持90s;汽化室温度250℃、检测器温度300℃;载气为氢气(2mL·min-1)、尾吹气为氮气(30mL·min-1);柱前压68.95kPa;进样量lμL,进样分流比100∶1.1.3.3相似度与保留时间系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值确定目标组分的存在,采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量,再将二者与系统谱库中的标准菌株数值匹配计算相似度(similarityindex,SI),从而给出一种或几种可能的菌种鉴定结果.一般以最高SI的菌种名称作为鉴定结果,但当其报告的几个菌种的SI比较接近时,则根据色谱图特征及菌落生长特性进行综合判断.以脂肪酸混合标样校正保留时间.1.4内生菌的制备将各供试内生菌株在NA平板上活化后,用NA培养液于30℃、170r·min-1振荡培养48h,备用.拮抗测定试验采用改良的琼脂扩散法.(1)病原真菌在PDA平板上培养2-5d,用无菌水冲洗菌苔配成孢子悬浮液,吸取1mL制备好的孢子悬浮液,加入到熔化并冷却到45℃左右的6mLPDA培养基(琼脂含量为0.9%)中,混匀后倾覆在已凝固的PDA平板上,待上层培养基冷却凝固后,在平板上打孔(直径为6mm),在每个孔内加内生菌发酵液40μL,将平板置于25℃培养2-4d后观察抑菌情况及抑菌圈大小.(2)病原细菌在NA培养液中发酵培养至对数生长期;吸取制备好的发酵液1mL,加入到熔化并冷却到45℃左右的6mLNA培养基(琼脂含量为0.9%)中,混匀后倾覆在已凝固的NA平板上,待上层培养基冷却凝固后,在平板上打孔(直径为6mm),在每个孔内加内生菌发酵液40μL,将平板置于25℃培养1-2d后观察抑菌情况及抑菌圈大小.上述每处理均设3个重复,以无菌水为对照.2结果与分析2.1内生细菌的分离与利用供试茶叶样本内生菌分离培养的试验结果见表2、3.从7份样品中共分离到16株细菌,1株真菌,未分离到放线菌.不同生长状态、品种、种植方式和加工方式的茶叶样本的内生菌种类和含量均存在一定的差异.新鲜采摘的福云六号和大白毫老叶中均未检测到内生菌,而芽叶中均存在着大量的内生菌,分离到的内生菌数量为26.5×106-139.5×106cfu·g-1.同样是有机种植,福云六号芽叶的含菌量为51.5×106cfu·g-1,是大白毫的1.94倍.常规种植的大白毫芽叶含菌量为97.5×106-139.5×106cfu·g-1,明显高于有机种植(26.5×106-28.3×106cfu·g-1).杀青工艺对有机种植的大白毫芽叶内生菌含量没有明显影响,却使常规种植的大白毫芽叶内生菌含量降低30.1%.样品Ⅰ号分离到4株不同菌落形态的细菌,样品Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ号各分离到3株不同菌落形态的细菌.同时,Ⅲ号样品还分离到真菌1株.上述菌株分别编号为Eb646-Eb662.内生细菌在茶叶中的含量差异显著,含量最小的Eb656仅为2.0×106cfu·g-1,含量最高的Eb651高达115.0×106cfu·g-1.2.2茶树内生细菌将分离出的16株细菌的脂肪酸气相色谱检测与MIDI数据库比对结果列于表4.从表4可见,在TSBA50数据库中,菌株Eb648、Eb650、Eb651、Eb652、Eb653、Eb654、Eb658、Eb660的相似度(SI)在0.500以上,表明为典型菌种;其中Eb648为类球红杆菌(Rhodobactersphaeroides),Eb650为放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter),Eb651为砖红色微杆菌(Microbacteriumtestaceum),Eb652、Eb658为争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus),Eb653为Rhizobiumrubi,Eb654为树状微杆菌(Microbacteriumarborescens),Eb660为蛾微杆菌(Microbacteriumimperiale).菌株Eb649、Eb656、Eb657、Eb659、Eb661、Eb662在TSBA50、TSBA40、CLIN50数据库里的SI均介于0.300-0.500之间,匹配性较低,为非典型菌种.结合平板菌落形态,除去Eb657以外的其他5株菌的鉴定结果均确认为正确.而Eb647、Eb655在所有数据库中找到的SI都很低,数据库没有这些菌种的数据,有可能为新种.Eb657、Eb647和Eb655菌株有待于进一步鉴定.将上述已确认的13株菌株根据样本来源进行分类,结果见表5.大白毫带有红杆菌属(Rhodobacter)、微杆菌属(Microbacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和贪噬菌属(Variovorax)共4个属的内生细菌.福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌.两种茶树品种都含有的内生细菌为放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)和争论贪噬菌(Variovoraxparadoxus).2.3抗菌活性化合物茶叶内生细菌抑菌谱测定结果见表6.Eb648在保存中缺失,因此仅15株茶叶内生细菌用于抑菌谱的测定.供试内生细菌对猪大肠杆菌K88、黄曲霉、甘蓝轮枝菌、泽泻白斑病菌和苦瓜炭疽菌均未表现出抑制活性.11株分别对番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果斑病菌、棉花黄萎病大丽轮枝菌、西瓜枯萎病尖孢镰刀菌和番茄枯萎病尖孢镰刀菌具有拮抗作用.在15株供试内生细菌中,Eb659号菌株抑菌谱最广,能够抑制3种病原菌,即番茄青枯雷尔氏菌、西瓜细菌性果斑病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌;Eb656、Eb657、Eb658、Eb660、Eb661、Eb662各抑制2种病原菌;Eb652、Eb653、Eb654、Eb655号各抑制1种病原菌;而Eb647、Eb649、Eb650、Eb651未对供试的10种病原菌表现出拮抗活性.3茶树内生菌群落特征植物体内存在大量有益的内生细菌和内生真菌,这些内生菌在植物体内有着多种生物学功能,可以提供植物所需要的营养物质及一些激素,参与植物的防卫功能,能够促进植物快速生长,增强植物抗逆境、抗病害、抗动物危害的能力.已有报道表明,福建茶树优良品种铁观音、黄旦、毛蟹、肉桂的茶叶存在内生细菌和内生真菌,其中分离到的内生细菌数量为2.9×106-39.4×106cfu·g-1.本研究在福建茶树品种福云六号和大白毫的芽叶中也分离到26.0×106-139.5×106cfu·g-1内生细菌,经脂肪酸鉴定从属于红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属.植物内生菌生活在活体植物组织中,其生长代谢受多方面因素制约,包括宿主植物和外界环境因子等.在茶叶内生菌的研究中,谢丽华等发现茶树品种黄旦的内生真菌分离频率达100%,而福云六号只有7.5%;同时随着茶树叶片的成熟,叶片中内生真菌的种类与数量逐渐增多,但在成熟的茶树叶片组织中,内生细菌的分离频率很低,表明茶树品种(或遗传背景)与叶片龄期影响内生菌的种群结构.本研究在大白毫中分离到1株内生真菌,在福云六号中未分离到内生真菌;在福云六号和大白毫的老叶中均未分离到内生细菌,而两种茶树品种的芽叶中均分离到3-4种内生细菌;大白毫带有红杆菌属、微杆菌属、根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌,福云六号仅含有根瘤菌属和贪噬菌属的内生细菌.上述结论证实了茶叶内生菌的种类与分布因茶树品种和叶片龄期而存在差异.此外,本研究还发现种植方式和杀青工艺也会影响茶叶内生菌的存在,如常规种植的大白毫芽叶明显高于有机种植的,并且杀青工艺使常规种植芽叶的内生菌含量大幅度下降.关于植物内生菌在防治病害、促进植物生长发育、固氮方面以及农残降解上的作用,国内外都有研究.洪永聪等从茶叶上分离筛选对茶树叶斑病防病效果好、对拟除虫菊酯类农药降解效能高的内生细菌,所有的分离菌株中有l4株对4种茶树叶斑病菌都有不同程度的拮抗效果,且在氯氰菊酯平板上生长良