基因工程的原理和技术

什么叫基因工程？基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。核心——构建重组DNA分子科技探索之路基因工程诞生的理论基础：DNA是生物遗传物质的发现、DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定基因工程的技术保障：？DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“基因的剪刀”）DNA片段的连接工具（“基因的针线”）基因转移工具（“运载体”）基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：重播大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。一、“基因的剪刀”——限制性核酸内切酶二、“基因的针线”——

DNA连接酶

DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。作为运载体的必要条件能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害三、基因的运载工具——运载体常用的运载体：1）细菌细胞质的质粒

2）噬菌体或某些动植物病毒质粒是细胞染色体外能够自主复制的双链环状DNA分子。存在于细菌、酵母菌和放线菌等生物中。1.水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是 A．促使目的基因导入宿主细胞中 B．使目的基因容易被检测出来C．促使目的基因在宿主细胞中复制 D．使目的基因容易成功表达B2．现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图l。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。下列相关叙述正确的是BA．酶H有2个识别位点和切割位点B．酶B和酶H同时切割时，有3个识别位点和切割位点C．酶B和酶H同时切割时，能产生完全相同的酶切片段D．酶B和酶H有相同的识别和切割位点3．下列关于生物工程中常用的几种酶的叙述中，错误的是A．一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，能用于提取目的基因B．DNA连接酶可把目的基因与运载体黏性末端的碱基黏合，能形成重组DNAC．纤维素酶、果胶酶可分解细胞壁，能用于原生质体的制备和培养D．胰蛋白酶能使动物组织分散成单个细胞，能用于动物细胞培养B练习1.下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，判断正误

A．a通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构B．b识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对×××2.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接B第二节基因工程的原理和技术阅读课本P5-7页回答以下问题:1.简述基因工程的基本原理2.概述基因工程操作的基本步骤获得目的基因形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达一、获取目的基因1.获取目的基因的方法（1）已知目的基因序列时，可以用人工合成的方法反转录法化学合成法目的基因的提取方法：人工合成A.反转录法：目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成已知目的基因的序列时B.可以从无到有合成2.利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应(PCR)，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。循环变性退火延伸目的基因的扩增呈指数形式扩增（2n）PCR技术①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________。前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板(已知基因的核苷酸序列)四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物⑥过程：a.DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b.退火（复性50℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c.延伸（70℃-75℃）：在DNA聚合酶的作用下，从引物延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA双链

基因组文库的构建

将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。3.如果未知基因的序列:建立基因文库基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因比较基因、目的基因、基因文库的区别基因：有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的遗传物质的基本结构和功能单位目的基因：是基因工程操作中需要的外源基因二、形成重组DNA分子——核心步骤质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIHindIIISmaI目的基因质粒1.图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,能不能使用SmaI切割?为什么?思考2.若将图中的目的基因插入载体,需要用哪一种限制酶同时切割载体和目的基因?3.与只使用EcoRI相比较,使用BamHI和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？三、将重组DNA分子导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术获得重组质粒体外显微注射入受精卵受精卵移植1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。四、筛选含有目的基因的受体细胞导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少怎样筛选？AmprTetr氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因目的基因插入四环素抗性基因中将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上然后将菌落平移按到含四环素的培养基上培养从分子水平进行筛选DNA分子杂交DNA探针含有目的基因不含目的基因重组DNA鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等五、目的基因的表达目的基因的表达是基因工程完成的标志插入哪一条染色体、插入某一染色体的位置都是随机的，这样可能破坏正常基因的结构和功能，使受体细胞不能完成某项生命活动甚至死亡。目的基因插入动植物细胞基因组的随机性问题糖蛋白是蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网上加工完成的。内质网存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这种细胞器，因此，由大肠杆菌中生产糖蛋白是不可能的。基因工程中生产糖蛋白，为什么不选大肠杆菌而选酵母菌为受体细胞？这就可以解释基因工程中为何用大肠杆菌生产人胰岛素原、而用酵母菌生产干扰素。◆用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是A．常用相同的限制性内切酶处理的基因和质粒B．DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达

B◆下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥ C．①②③④ D．①②④⑥D◆基因工程又叫基因拼接技术。

(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的

为模板，

成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成

。

(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、

。(3)假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有

种环状DNA分子，它们分别是

。信使RNA

逆转录

双链DNA(目的基因)动植物细胞

3

质粒自连的、目的基因片段自连的、质粒与目的基因片段相连的环状DNA分子◆继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。（2进行基因转移是，通常要将外源基因转入___________中，原因是_____________。（3）通常采用_______技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的________细胞中特异表达。

(5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的___

__转入________细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为_______显微注射法

受精卵（早期胚胎）

受精卵（或早期胚胎）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达DNA分子杂交

膀胱上皮

细胞核

去核的卵

核移植（或克隆）

◆（2009高考-X江苏）人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。（3）已知限制酶E识别序列为CCGG,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成_____个片段，而患者的则被切割成长度为________对碱基和________对碱基的两种片段。（4）如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型是________（以P+表示正常基因，Pn表示异常基因）。◆（10江苏卷）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1