番木瓜内生生防菌的筛选及防病性研究

番木瓜内生生防菌的筛选及防病性研究

番木瓜（番木瓜）也被称为comoji。它是热带和亚热带地区广泛种植的水果。疫病(Phytophthoranicotianae)和炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是番木瓜生长和果实采收后贮运期间经常发生的病害。目前生产上主要依靠使用化学杀菌剂防治这些病害,因此也可能带来环境污染、农药残毒和抗药性等一系列问题,不仅影响番木瓜品质,而且危及人类健康,对生态环境也构成很大的威胁。为寻求安全有效的防治措施,植物病害的生物防治方法越来越引起人们的关注。近年来不少研究表明,植物体内存在对植物病原菌具有拮抗作用的内生菌,这些内生菌由于存在于植物体内不易受外界环境条件的影响,可较好地发挥生物学作用,是植物病害生物防治的天然资源菌。国内外已有关于从小麦、马铃薯、板栗和辣椒等多种植物体内分离筛选到具有防病作用的内生细菌的研究报道,但少见关于番木瓜内生细菌的研究报道。为了获得对番木瓜疫病和炭疽病等病害有较好防治效果的内生菌,我们对从番木瓜果皮内分离到的内生细菌MG-Y2进行了分类地位、拮抗作用、定殖能力和防病效果的初步测定。1材料和方法1.1菌株分离和纯化培养试验材料取自广东惠州,采收无病害症状、成熟度为果皮表面轻微呈现三条黄色(俗称“三线黄”)的番木瓜果实。采用组织分离法和稀释分离法分离果皮中的内生细菌。在28℃下培养48h后,挑取培养特征相异的单菌落,重复在新的平板培养基上划线纯化培养,然后移入试管斜面培养基上置于4℃冰箱内保存。每次供试前移到平板培养基上在28℃下活化培养48h。1.2菌株和病毒株番木瓜疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)、番木瓜炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、荔枝霜疫霉病菌(Peronophythoralitchii)、枇杷黑斑病菌(Alternaria.mali)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、辣椒软腐病细菌(Erwiniacarotovora)、菜心炭疽病菌(Colletotrichumhiggisianum)、鸡冠花叶斑病菌(Fusariumoxysporum)由华南农业大学园艺学院植物病理教研室提供。内生细菌平板培养采用NA培养基,液体培养采用NB培养基,提取DNA的菌体培养用LB培养基,病原菌培养及拮抗作用测定采用PSA蛋白胨培养基。1.3内生细菌菌悬浮液制备采用抑菌圈法测定MG-Y2对8种病原菌的拮抗作用。配制供试病原菌悬浮液,分别加入到45℃左右的培养基中,混合均匀后倒成含供试病原菌的培养基平板,在平板中央移入一块直径为5mm的内生细菌菌苔,在28℃下培养3d,测量抑菌圈半径。每处理6个培养皿,3次重复。1.4抗rif.4.4重组菌株的筛选采用抗利福平(Rif.)标记法测定MG-Y2在番木瓜植株内的定殖能力。用含有抗生素Rif.的NA培养基逐步筛选抗Rif.的MG-Y2,直到筛选出能在含300μg/mLRif.的NA培养基上稳定生长的MG-Y2。在番木瓜结果期,用浓度为108cfu/mL的抗Rif.菌株培养液田间喷施番木瓜植株,以喷自来水作为对照,接种后定期取番木瓜的叶片、叶柄、果皮和果肉,用含100μg/mLRif.的NA培养基分离回收供试菌株。每处理8株,3次重复。1.5mg-y2的生理生化性能的测定MG-Y2的形态特征、培养性状和生理生化特性的测定主要参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行。1.6srrna的pcr扩增内生细菌的总DNA用细菌基因组DNA小量抽提试剂盒(TaKaRa公司,大连)提取,以上述DNA为模板,采用扩增细菌16SrDNA的通用引物(F:5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’,R:5’-CC-CGGGATCCAAGCTT-3’,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)扩增目标细菌的16SrDNA,PCR反应体系为:10×反应缓冲液5μL,20mmol/LdNTPs4μL,10mmol/L正反向引物各2μL,ExTaqDNA聚合酶(5U/μL,TaKaRa)0.5μL,模板DNA10ng,最后加ddH2O至终体积50μL。PCR扩增反应条件为:94℃变性3min;94℃变性1min,50℃复性45s,72℃延伸2min,循环数为30;72℃充分延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后分别连接BamHⅠ和HandⅢ酶切的克隆载体PMD-18(TaKaRa,大连),转化EscherichiacoliDH5α并测序(上海英骏生物科技有限公司广州分公司)。对得到的DNA序列采用GenBank中的BLASTN软件以及RDPⅡ(RibosomalDatabaseProjectⅡ)中的SEG-MATCH进行同源性比较。利用DNAStar5.0对测序得到序列及参比序列进行聚类分析。1.7测定病情指数采收时果实成熟度为果皮表面出现轻微的黄色(俗称“一线黄”),采后清洗晾干。用MG-Y2培养液(28℃,150r/min振荡培养24h,浓度为108cfu/mL)浸泡1min,以用自来水浸泡作为对照,晾干后用0.03mm厚聚乙烯薄膜袋单果包装置于25℃温度下贮藏。48h后喷雾接种番木瓜疫霉病菌孢子囊悬浮液(104个孢子囊/mL)或番木瓜炭疽病菌分生孢子悬浮液(104个分生孢子/mL),接种后立即用薄膜袋单果包装置于25℃下贮藏。分别于2d和7d后开始调查病情指数。每处理8个果,3次重复。2结果与分析2.1抗菌材料筛选结果2003—2005年从番木瓜果皮内分离到103株内生细菌,通过对这些内生细菌进行离体拮抗作用测定,得到3株对番木瓜疫霉病菌等病原菌有明显拮抗作用的菌株(图1),从这些拮抗菌中筛选出的菌株MG-Y2对供试的8种病原菌有较强抑制作用(表1)。2.2分离回用内生细菌用含100μg/mLRif.的NA培养基分离回收MG-Y2,在采用喷雾接种的番木瓜植株叶片、叶柄、果皮、果肉中均分离到内生细菌,而用自来水作为对照处理植株体内均未分离到内生细菌。经检测,分离到菌株与MG-Y2在培养性状、形态特征、生理生化特性以及对病原菌的拮抗作用等方面完全相同,表明分离回收到的内生细菌是原来接种上的MG-Y2。喷雾接种后,MG-Y2在番木瓜叶片、叶柄、果皮和果肉内的定殖数量均呈先升高后下降的趋势(表2)。2.3菌体的大小MG-Y2菌株革兰氏染色阴性。在光学显微镜和扫描电镜下,菌体呈杆状,大小为0.7~1.1μm×2.0~4.0μm,不产芽孢,具有单端双鞭毛,能运动。在NA培养基上(28℃)培养48h后,菌落呈乳白色,菌落光滑、湿润、透明。2.4bioar的生长特性MG-Y2菌株与恶臭假单胞菌生物变种Ⅰ(PseudomonasputidabiovarⅠ)的生理生化特性相同,该菌株在4℃温度下可以生长,在41℃下不能生长,不产生吲哚,V-P测定呈阴性,接触酶阳性,不能水解淀粉,不能使明胶液化,可以利用葡萄糖和果糖,DNA的G+Cmol%含量为62.5%(表3)。2.5数据库中同源性分析以内生细菌MG-Y2总DNA为模板,通过引物63F和1387R扩增,结果获得1条大约为1.5kb的特异片段。回收该片段进行序列测定。测序结果用GenBank和RDP数据库进行同源性分析,在2个数据库中的同源性分析表现了一致的结果:该片段与数据库中的恶臭假单胞菌(Psudomonasputida)(GenBank登陆号:AE015451.1)之间的同源性最高,达到99.6%。同时从BLASTN分析得到的结果中另外选取6个同源性高低不同的菌株进行多重序列比较,并做系统发育学分析。系统发育学分析结果表明:MG-Y2与PsudomonasputidaKT2440遗传距离最小(图2)。2.6mg-y2对甘蔗、番茄和树梢病的预防用MG-Y2浸泡处理的番木瓜疫病和炭疽病的发生速度显著低于对照,但防病效果随着时间的延长逐渐降低(表4,5)。3meq2微生物菌种的确定恶臭假单胞菌是一种广泛存在于土壤、水和植物体中的植物非致病菌,对多种植物病原菌有拮抗作用,对豆类灰霉病、棉花枯萎病、马铃薯细菌性黑腐病等多种植物病害有控制作用[10,11,12,13,14,15]。MG-Y2菌株在形态和生理生化特性等方面与恶臭假单胞菌相同,是一株番木瓜内生恶臭假单胞菌。该菌不仅对属于高等真菌的番木瓜炭疽病菌、菜心炭疽病菌、枇杷黑斑病菌、鸡冠花褐斑病菌和属于低等真菌的番木瓜疫霉病菌、辣椒疫霉病菌、荔枝霜疫霉病菌有抑制作用,而且对属于细菌的辣椒软腐病菌亦有较强的抑制作用。在番木瓜采后防病试验中,MG-Y2对番木瓜果实疫病和炭疽病均有较好的防治效果。前人的研究报道和本研究的结果都显示了恶臭假单胞菌在植物病害生物防治方面有潜在的应用前景。关于MG-Y2的寄主范围、生物学特性、防病机理以及与其它菌株之间的相互关系有待进一步研究。在分离番木瓜果实中内生细菌的试验中发现,番木瓜果实中内生细菌数量多,是一个混合的复杂菌群,从番木瓜果实内生菌中除筛选到MG-Y2外,还筛选到另外2种对植物病原菌有较强抑制作用的内生细菌,开发利用这