植物组织培养中常见的污染问题

植物组织培养中常见的污染问题

植物组织培养是20世纪初以植物为基础的一项新兴技术。该技术在科学研究和生产中得到广泛应用，是世界著名生物技术的重要组成部分。特别是近几年,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗,使作物种植逐步摆脱周期长、完全受自然控制的分散状态,逐步走向集中控制、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产。尽管组织培养方面理论研究已相当精深,但技术方面仍存在很多问题。因此,如何获得无菌苗也成为亟待研究的问题。在总结分析有关文献的基础上,结合多年生黑麦草Loliumperenne组织培养研究中的实践,介绍和讨论了组织培养中的污染原因及其对策。在组织培养中污染经常发生又难以控制。造成污染的原因多种多样,如外植体的种类,取材的季节、时间、预处理方法,消毒药剂的种类、浓度,消毒时间,消毒方法,培养基和器皿灭菌,操作人员,工作环境,超净工作台的工作质量等都与污染密切相关,导致污染成因的复杂性。依据上述因素,将污染原因归结为3个方面:一是组织培养室或接种室的清洁问题;二是外植体自身带菌;三是组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。1接种室的消毒在进行组织培养之前,首先要建立实验室。实验室包括准备室、无菌操作室(接种室)和培养室。植物组织培养是一种要求做到无菌操作和无菌培养的技术(这种技术有2个主要目的:一是防止实验室的培养物被外来微生物,如皮肤、衣服或周围环境中的微生物污染;二是防止实验工作者被微生物感染)。组织培养室或无菌操作室的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子,若培养室内不清洁就会引起细菌和霉菌污染。因此在接种室每次接种前必须进行彻底地消毒,常用的方法是先用70%酒精在室内喷雾使空气中的细菌和真菌孢子沉降,在接种前后要用70%的酒精或者1∶50的新洁尔灭湿性消毒溶液擦洗超净工作台,每次接种前还要用紫外线灯照射20~60min,以净化空气,工作人员不能在停止照射后即刻进入室内,以免紫外线辐射对人体的影响。接种前应再次进行超净台台面消毒,可用新洁尔灭湿性消毒溶液擦抹和70%酒精消毒,保证超净工作台处于严格的无菌状态。在接种后要及时打扫卫生(清洁工具如扫帚、拖把必须消毒),用2%的新洁尔灭溶液擦洗地面、墙壁和门窗。组织培养室要经常用70%酒精喷雾和2%的新洁尔灭溶液擦洗地面和门窗。有些真菌适应性很强,上述措施不一定奏效,因此,对组织培养室或接种室一般用高锰酸钾和甲醛每周熏蒸1次,甲醛用量4~6mL/m3,高锰酸钾3~6g/m3。2组织性微生物污染在组织培养中,无菌的外植体是植物组织培养取得成功的最基本前提,特别是在热带、南亚热带,由于常年高温多雨,空气湿度大,在植物茎叶表面容易滋生大量的微生物,一些菌丝体甚至侵入表皮内的薄壁组织,不能被一般的表面消毒方法所清除,材料被带入组织培养过程中易引起内生菌的污染,如细菌的污染。因此,必须选择合适的外植体(如成熟的种子、健壮植株等),并进行严格的消毒和无菌操作,以确保组织培养工作的顺利进行。2.1采用外植体法生产大型植物外植体的选择要以污染少易启动(易培养)为原则。迄今为止,组织培养获得的成功,几乎包括了植物体的各个部位,如茎尖、茎段的皮层及维管组织、髓细胞、表皮,块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。其中植物胚不易被污染且具有幼嫩的分生组织细胞,是常用的外植体。另外在用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养,如将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其抽枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,污染率可下降到20%~30%。罗小芳等人在金丝小枣Ziziphusjujubavar.inermis快繁中用休眠芽、室外嫩茎及水培嫩芽为外植体,得出水培嫩芽的污染率为31%,存活率高达63.3%,而休眠芽和室外嫩茎的污染率分别为46.2%,77.1%,成活率16.25%,17.14%。在无菌条件下对枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时再采取枝条,也可明显减少污染。另外也可用成熟种子在无菌条件下经严格消毒培育成无菌苗,然后采用无菌芽苗的胚轴、胚根、子叶等为材料,也可减少污染,笔者在多年生黑麦草的组织培养中采用此法。同时,应避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采料时,下午采取的外植体要比早晨采的污染少,这主要是因为经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。当然,外植体的选择在考虑污染控制的同时,还应考虑外植体的分化率问题。例如,在控制污染条件一致的情况下,百合科Liliaceae植物鳞茎不同部位的再生能力差别很大,外层鳞片叶比内层的再生能力强,下段比中、上段再生能力强;多年生黑麦草的草坪草品种百瑰易灭菌,但分化率极低。因此,组织培养过程中,选择不易污染且易表达全能性的外植体,是成功建立组织培养体系的决定因素之一。2.2种子消毒和消毒外植体灭菌方法有表面灭菌和深灭菌。如以茎尖、茎段和叶片等为较嫩外植体材料时,常用表面灭菌方法,其具体方法:先用自来水冲洗数分钟(对于表面不光滑或长有绒毛结构不易洗净的材料冲洗时间要长,几个小时或过夜),用软毛刷(添加洗洁净或肥皂粉)进行刷洗以去除尘土,用吸湿纸吸干,接着浸泡到灭菌溶液(如70%的酒精)中,用无菌水冲洗2~3次;再用表面消毒剂如0.1%~0.5%氯化汞或1%~2%(体积/重量)溴水或2%~10%次氯酸钠浸泡,一般对较易灭菌的外植体采用2%~10%次氯酸钠浸泡即可,而对较难灭菌的荚果类采用0.1%~0.5%氯化汞才能较好灭菌。如Luan等在红花刺槐Robiniapaeudoacacie茎段组织培养研究中取带1~2个小侧芽的小茎段,先用酒精灭菌30s,然后在0.1%升汞中灭菌3~5min,其消毒效果好。一般的灭菌材料在灭菌剂中浸泡时间的长短以及灭菌剂浓度的高低以不同外植体而定,如李慧等在草莓茎尖组织培养中比较了5种不同灭菌方法,分别是次氯酸钠10%(含有效氯0.4%~0.5%)浸泡接种材料10~15min;次氯酸钙(漂白粉)饱和上清液浸泡材料15~30min;过氧化氢10%~12%浸泡10~20min;新洁尔灭溶液5%~10%浸泡10~15min;升汞0.1%浸泡8~10min,结果显示前4种灭菌剂对接种材料比较安全,但因灭菌时间较长,常常使接种材料的外层氧化变褐,影响培养效果。虽然升汞有很强的杀菌能力,但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。因此,组织培养中,把握好灭菌时间和灭菌剂浓度很重要。对于种子等难消毒的材料常用深灭菌方法,一般用20%次氯酸钠溶液浸泡20~30min,较难消毒的可用0.1%升汞消毒5min。对不同植物材料种子的灭菌方法也不相同,在禾本科Gramineae种子与豆科Leguminosar种子灭菌中,由于禾本科草种种皮较薄且小,较易灭菌,而豆科植物种皮较硬且厚,必须深灭菌才能彻底灭菌并打破休眠。赵永辉等对结缕草Zoysiajaponica种子的灭菌先采用乙醇浸泡2min,再用次氯酸钠溶液浸泡20min时消毒效果好。若材料表面不光滑,最好在灭菌液中加入1~2滴表面活性剂,如吐温80或吐温20,可以湿润外植体整个组织,促进灭菌液进一步接触表面组织,达到好的消毒效果;有时还可用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒液进入外植体。消毒后用无菌水冲洗3~4次后,用无菌纸吸干,在无菌条件下用解剖刀切取所需大小的茎尖、茎段,用灼烧后退热的镊子将切割好的外植体插到培养基表面上,包上封口膜,放到培养架上进行培养。表1归纳了组织培养中常用的灭菌剂。3超净工作台的过滤装置污染这类污染是指除外植体带菌和环境污染以外的人为污染,一般可以避免。造成这类污染的主要原因:操作过程中培养基或工具(如镊子、剪刀和器皿)等灭菌不彻底;超净工作台的过滤装置能力欠佳;操作人员不遵守操作规程自身带菌等。这类污染的预防措施主要从以下几点做起。3.1灭菌方法必须采用有效的方法,将所用培养器皿、培养基、操作工具、培养材料、接种间进行灭菌。通常,灭菌有物理方法和化学方法2种。高压蒸汽、烘箱干热、紫外线照射为物理方法灭菌。0.1%新洁尔灭溶液、70%酒精、漂白粉或3%~7%漂白精片、甲醛、次氯酸钠溶液等消毒剂都属于化学方法灭菌或抑菌。3.1.1灭菌锅内为了保证灭菌彻底,培养基以及培养器皿灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法灭菌,因为空气是热的不良导体。对于半自动高压灭菌锅来说,灭菌过程中当锅内压力上升到0.5kg/cm2时,应注意再次开启放气阀1次,将锅内冷空气排净,否则冷空气就会聚集并滞留在灭菌锅消毒筒的中下部,围绕在正在灭菌的材料周围。在这种情况下,假如锅内空气仅排掉一半,当压力表指针达到1kg/cm2时,锅内实际温度仅达112℃,比要求的121℃低很多,导致灭菌不彻底,可能造成大面积染菌(全自动高压锅不存在这种问题)。灭菌锅的压力应稳定在1.1kg/cm2,即温度为121℃的条件下,维持15~20min,时间不宜过长,也不可超过规定的压力范围,否则培养基中的蔗糖、有机物质、维生素、激素等物质就会分解,导致培养基变质、变色,降低培养基的pH值,使培养基难以凝固。灭菌完成后,切忌立刻打开放气阀放气,因为锅内气压降低太快会引起减压沸腾,导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出,甚至造成人身事故。应在灭菌锅内气压接近常压时打开放气阀。3.1.2冷却、破碎器玻璃器皿可采用烘箱干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法灭菌,前者可置于150℃下40min,然后将温度降到120℃下处理2h;器皿放入烘箱以前必须干燥,以免引起破碎;温度宜缓慢上升,灭菌后,待温度逐渐下降到60℃以下,才能打开箱门,以免因突然冷却,致使器皿破碎。使用高压灭菌锅时则压力为1.1kg/cm2,即温度121℃的条件下维持20~30min。3.1.3刀具冷却干燥接种用的刀、镊子、剪刀等一般采用化学方法灭菌,使用前用酒精棉球擦拭,并在火焰上灼烧,然后冷却备用;物理灭菌法则将刀具用水煮沸5min,用无菌水冷却后备用;或者将金属用具用酒精药棉擦拭干净后风干,然后于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,冷却后备用。经上述方法处理的器具在使用时还需在无菌条件下用70%酒精消毒,再在酒精灯上烧灼后才能使用。3.2过滤器、接液瓶的灭菌对于一些不能进行高温灭菌的液体培养基或植物生长调节剂、抗生素等溶液,如赤霉素、吲哚乙酸(IAA)等高温易分解的物质,一般可采用2种方法灭菌:1)用灭菌过滤器过滤后加入其余已经高温灭菌的培养基中,一般认为0.2mm孔径滤膜可足以去除大部分细菌;如果灭菌要求不高,也可以使用0.45mm左右的滤膜。在操作过程中使用的过滤