植物组织培养中污染的分析与防治

植物组织培养中污染的分析与防治

自20世纪初以来，植物组织的形成和发展经历了一个整合阶段、基础阶段和快速发展阶段。近年来,随着植物组织培养基础理论的深入研究,其发展迅速,应用范围也更广泛,在农业、林业和医药等领域产生了巨大的经济效益和社会效益。虽然植物组织培养基础理论研究水平很深,但是污染问题时有发生,严重时会导致试验和生产彻底失败,使科研和生产蒙受巨大损失。控制污染的发生,尤其在珍贵种质资源保存和大规模工厂化生产用苗中显得尤为重要。本文就植物组织培养中污染产生的原因以及控制措施作以论述。1污染原因1.1不同部位材料带菌培养(1)年龄、种类和大小。成年植株带菌多;生理年龄老的材料带菌多;杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株,均易污染;室外生长的材料带菌多;表面有泥土的材料、地下器官均带菌多;表面积大的材料比表面积小的材料带菌多。(2)取材时期和部位。雨季菌类繁殖旺盛,此时材料带菌多;阳光最强时紫外线较强,杀菌效果好,此时材料带菌较少;选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。(3)灭菌效果。外植体灭菌是组织培养的关键,灭菌效果直接决定了组织培养的成败,灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差,使外植体带菌。1.2培养容器、接种室和培养室污染(1)培养基。使用长菌的母液配制培养基;培养基pH值高、添加的有机成分均可导致细菌污染;培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌;培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染;封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂,导致密封性差,不慎使用后可能导致培养基污染;橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂,杂菌可能趁机进入培养容器;灭菌方法不当导致培养基污染;灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底;灭菌时间达到后立即打开灭菌锅,导致容器内压力差过大,使外部杂菌有可能被倒吸入容器中;过滤较多溶液后,滤膜过滤效果较差,使过滤后的溶液有菌,加入培养基后造成污染。(2)培养容器和接种器具。培养容器不清洁;培养容器被污染后灭菌不彻底,再次使用时导致污染;高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满,影响灭菌效果;培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底;灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱,强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。(3)接种人员。过长指甲;双手未清洗干净;衣服和头发有很多灰尘,接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩;不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台,转接后再次污染;培养容器中接种的培养物过多;超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住,导致灭菌效果差;接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌;操作时手超出工作台面;手接触培养容器边缘,放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中;打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘;接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒,再次使用后又污染了材料;没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中;中途离开超净工作台后马上又继续接种,将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘,顺风飘入器皿。服装、帽子、口罩、拖鞋长期穿戴后较脏,表面有大量灰尘,未经清洗反复穿戴后造成污染。(4)接种室和培养室。人员的进出导致接种室和培养室空气中存在大量细菌和真菌,尤其是接种过程中非工作人员的进出;接种室设计不合理,造成室内灰尘、细菌过多;超净工作台置于灰尘太多的地方,过滤装置使用过久、保养不当造成失效;组培室、接种室门窗封闭不严,苍蝇等趁机飞入,利于杂菌传播;培养室面积大易污染,室内温度高、空气湿度大,菌类繁殖旺盛也会加重污染。2避免措施2.1外植体的选择和消毒2.1.1黄化病植株的选择选取幼年植株或生理年龄为幼态的材料;外植体要求杂菌少、易启动且内生菌少,宜选取生长健壮的植株材料,如胚和无病害的茎尖;从温室或人工气候室生长的植株上选取外植体,选取水培抽出的茎段、叶片等;新萌发的萌蘖条,新生的枝条、茎尖、叶片、叶柄;黄化处理后的枝条;表面污染较重的可对母本植株进行修剪,待长出新枝后再取外植体;选取表面积小的材料。一般以材料积累了丰富的营养和内源激素为宜,此时材料抵抗病原菌的能力较强或病菌较少,以材料休眠末期或萌动前期取材较为有利,取材多在晴天中午阳光最强时进行;取材部位以材料中下部较好。2.1.2次氯酸钠的杀菌效果灭菌剂需有良好的灭菌效果,不会对外植体造成损伤或损伤较小,且容易用无菌水冲净或能自行分解,不会在外植体上残留而影响其生长。常用的灭菌剂有70%酒精、0.1%~1%升汞(氯化汞)、1%~10%滤液的漂白粉、0.5%~10%次氯酸钠溶液、3%~10%双氧水和4~50mg·L-1抗生素。70%酒精杀菌效果好,有润湿作用,能排除外植体表层组织的空气,有利于其它灭菌剂的渗入,但穿透力强,应严格控制灭菌时间。升汞对材料表面灭菌效果最好,但残留的汞难以除去,其毒害作用在培养一段时间后才能表现出来,因此灭菌后要将材料冲洗干净。漂白粉杀菌效果很好,需避光、干燥贮存。次氯酸钠可分解生成有杀菌作用的氯气而挥发。过氧化氢分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物。抗生素用来除去材料内部组织所带菌类,但抑菌单一、药效时间短、稳定性差、容易使菌类产生抗药性、高浓度影响植物生长等缺点使其应用受到了限制。为使灭菌剂能润湿整个组织表面,需要在灭菌剂中加入数滴润湿剂吐温-80或吐温-20,起到良好的灭菌效果。2.1.3不同消毒方法对芽和茎段的消毒效果抗生素处理。材料污染较重可对母本喷施杀菌剂或抗生素,Rugge等先用敌菌丹或异菌脲对田间披散山龙眼母树处理后再采集外植体,污染率由对照的90%减至14%。Mondal等在采集外植体前,先用1000mg·L-1的庆大霉素喷施番木瓜,取芽后再用庆大霉素处理,减轻了污染。热处理。小麦种子在55℃热水中保温3~5min;马占相思种子在100℃保温1min;此处理可杀灭种子表面的部分微生物。Langens等把美丽百合的鳞茎放到试管中进行43℃热击处理,罗伯利槭的休眠芽进行42.5℃或45℃热击处理,有效地减少了内生菌污染。低温处理。于福科等将刚采的玫瑰枝去掉叶和刺,在冰箱中放置7d后,选取带芽茎段培养。与对照相比,低温处理后的材料污染现象有不同程度的降低。臭氧消毒。焦立为等对橡皮树带有顶芽的叶片用臭氧进行消毒,污染率为0,顶芽(有鳞叶包被)接种后的成活率极高,而叶片和叶脉接种后成活率很低。用抗生素进行预处理。俄罗斯黑杨的茎段用皂液刷洗和75%酒精杀菌后,转入不同抗生素溶液中,在摇床上振荡过夜,然后用75%酒精和0.1%升汞分别灭菌1min和15min,灭菌效果以ANB1和ANB2的抑制效果较好,未污染率分别为36.7%和23.3%,成活率分别为60%和50%。朱广廉对相思树的芽和茎段灭菌时,先用皂液刷洗和乙醇杀菌后,将外植体转入0.2%benlete和0.2%链霉素混合溶液中,25℃、100r·min-1的摇床上振荡过夜(16h),再用80%酒精和0.1%升汞分别处理1min和15min,灭菌效果较好。Reuveni等将温室的番木瓜侧芽先用300mg·L-1利福平溶液进行预处理,然后按常规方法对其进行灭菌,控制污染的效果较好,且番木瓜生长良好。真空减压灭菌。周俊辉等对玛丽安万年青茎段用1g·L-1升汞真空减压抽滤灭菌8min,无菌水冲洗1~2次,然后用1g·L-1升汞浸泡5min,最后无菌水冲洗3~5次后接种,茎段污染率从常规处理的93.3%降到40.0%,成活率从3.3%上升到43.3%。魏占才等对俄罗斯银白杨茎段通过此法灭菌,未污染率从常规灭菌的6.7%升高到60.0%,成活率从3.3%升高到43.3%。磁力搅拌和超声波振动。肖显华等用0.1%升汞对苹果的茎段磁力搅拌15~20min,再用无菌自来水磁力搅动清洗5次,每次5min,有效地降低了污染率和死亡率。灼烧。Ruiz等将马蹄莲的根在95%酒精中浸泡1min后,短时间地灼烧了2次,外植体切割时也灼烧了2次,与常规消毒相比降低了60%的污染率。此法也在蒜(Alliumsativum)的小鳞茎和银白杨芽的消毒过程中有应用。多次灭菌。王彭伟等对肾蕨幼嫩走茎用75%酒精浸泡10s,无菌水冲洗3次后,再用0.1%升汞+0.5%NaC1+吐温浸泡5min,然后用无菌水冲3次,接种前再用2.5mg·mL-1的卡那霉素或四环素液浸泡片刻取得较好的灭菌效果,既能较好地控制污染,又不损伤材料。此法在番木瓜、金线莲、菊芋、牛大力灭菌时也有应用,效果较好。多种灭菌剂混合灭菌。何云芳等在百合和半夏的试管繁殖中,使用升汞和NaClO混合液来防治污染,80%以上的外植体生长正常且无污染。周锦霞等以油樟带芽茎段为材料进行了不同表面消毒方式控制污染率试验。结果表明,Ca(ClO)2和升汞混合使用有利于降低污染率。另外,有使用混合灭菌剂对宽叶紫荆木、马蹄莲进行灭菌的报道。在培养基中加入抑菌剂。在培养基中单独使用1种抑菌剂,王亦菲等在彩色海芋快繁4~5代时,向培养基中加入200mg·L-1青霉素GK、羧苄青霉素和硫酸庆大霉素,比较不同抗生素对海芋内生菌抑制的影响,其中200mg·L-1的青霉素GK能有效地抑制内生菌的生长,对苗的生长也无明显影响。许婉芳等在金线莲组织培养时,在培养基中分别添加了3种1g·L-1的杀菌剂,结果表明50%多菌灵的效果优于70%甲基托布津和25%甲霜灵,抑菌率达100%,苗长势也最好。另有作者对枸杞、葡萄、绿巨人、马铃薯、迷你玫瑰、红掌、白网纹草、勿忘我、香水白掌、铁皮石斛做了此方面试验,抑菌效果较好。在培养基中同时使用2种以上的抑菌剂,如董玉芝等在树莓组培苗内生菌的抑菌试验,发现添加链霉素40µg·mL-1+氯霉素55µg·mL-1比单独使用青霉素的抑菌效果好,而且对植株的生长影响较小。此外,在长春蔓、广佛手、沙田柚、驱蚊香草、肾蕨、生姜、红掌的组织培养中也有应用,抑菌效果也较好。2.2运营规则2.2.1培养容器盖、封口膜的使用配制培养基的母液长菌后不能使用,应重新配制;适当降低培养基pH值;适当减少或去掉培养基中的有机成分;培养基分装后及时封口并立即灭菌;容器口要封严;塑料盖、封口膜应使用新的;用细绳代替橡皮筋绑培养容器口,或用多个橡皮筋把培养容器口封严;使用半自动高压灭菌锅时,先关闭放气阀,待锅内压力上升到0.03~0.04MPa时,打开放气阀排出冷气,再关闭放气阀。待锅内压力上升到0.105MPa,即温度为121℃时,灭菌15~40min;灭菌锅内培养基不要装得过满;灭菌时一定要达到适宜的灭菌时间;灭菌后等灭菌锅稍冷却后再打开;及时更换过滤膜。2.2.2培养容器、接种方培养容器清洗干净后储存好,防止落入灰尘;培养容器被污染后要彻底灭菌;高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具不要装得过满;灭菌时间适宜,采用高压蒸汽灭菌方法需灭菌30~40min,采用干热灭菌时160~180℃灭菌40min或120℃灭菌2h;灭菌结束后,待高压灭菌锅或烘箱冷却后再取器具,避免外部冷空气进入灭菌锅或烘箱使器具受到污染和发生炸裂。2.2.3做好材料的接种修剪过长指甲;进入接种室前双手用肥皂清洗干净,用70%酒精喷洒双手;接种时再用70%酒精棉仔细擦拭双手,接种过程中经常擦拭双手;接种前和接种过程中经常擦拭工作台面;进入接种室后换拖鞋、工作服、帽子和口罩,定期清洗工作服、帽子、口罩、拖鞋,并采用高压湿热灭菌处理,接种前对其进行紫外线照射;接种前仔细观察培养容器中的培养材料;培养容器中培养物宜少接种;超净工作台上物品不要摆放过多、过高;接种时用鼻子呼吸,手不要超出工作台面,不要接触器皿边缘,不要放在器皿、接种器械上方;解开橡皮筋、打开培养容器的塞子、盖或封口膜时动作要轻,培养容器应倾斜拿,用酒精灯火焰灼烧瓶口或在火焰附近打开封口膜来杀菌;接种器械每使用1次就要彻底灭菌,一定要在下风方向操作;中途离开超净工作台后应对接种室继续灭菌后方可接种,不要中途将培养基、器械等拿入。2.2.4做好消毒灭菌工作严禁随意进出接种室和培养室;接种室和培养室定期用甲醛和高锰酸钾混合物进行空气熏蒸灭菌(甲醛4~6mL·m-3,高锰酸钾3~6g·m-3);接种前应对接种室地面仔细清扫,用消毒水擦试地面、墙壁,并用70%酒精喷雾使空气中的灰尘沉降,超净工作台面用20%新洁尔灭或70%酒精棉仔细擦拭,并用紫外灯照射20min,接种前20min使超净工作台处于工作状态进行充分过滤灭菌;接种室密闭、干净,最好选择在二层以上的楼房并与