木本观赏植物组培快繁技术

木本观赏植物组培快繁技术

1植物细胞的全能性及再生作用的相关研究植物组织培养是指对植物器官（根、茎、叶、花、果实、种子等）进行人工制备的培养基，并给予适当的培养条件，以完成完整植物的过程。由于培养的是脱离植物母体的培养物,所以也叫植物离体培养或植物试管培养。植物组织细胞培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年德国著名植物学家G.Haberlandt根据细胞学理论,大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,即植物体细胞在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的潜力的观点。他曾用植物叶片细胞进行培养,但未能成功。这是因为20世纪初期,细胞学、生理学和遗传学等生物学的基础学科都处于襁褓之中。在之后的近半个世纪,人们虽然对培养基成分、植物激素等培养条件有不少重要发现和认识,然而一直未能由单个细胞或组织再生出完整植株。直到20世纪40年代末50年代初,Skoog和崔徽等用烟草髓组织培养诱导根、芽器官形成获得成功。随后,Reinert和Steward等分别报道在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚,并发育成完整小植株,从而证实了植物细胞的全能性。1960年英国学者Cocking用酶法首次从番茄根尖分离出大量有活性的原生质体,并通过培养再生出细胞壁。1971年Nagata首次通过烟草叶肉原生质体的培养获得了再生植株。之后,多种植物的原生质体再生植株都相继取得了成功,由此开创了植物组织培养研究的新局面。2植物组织培养的应用2.1花镜rosachinenus目前用于快速繁殖的植物1000余种,并且还不断有新的报道。市场上出售的组培苗主要是花卉、果木及经济作物。据不完全统计,仅观赏花卉而言,一般认为重要的包括60余科,近1000种,如月季(Rosachinensis)、菊花(Dendranthemamorifolium)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、花叶芋(Caladiumbicolor)、龟背竹(Monsteradeliciosa)、各类兰花等。其他植物如柑桔属(Citrus)、按树(Eucalyptusrobusta)、槭树属(Acer)和珍贵的针叶树等也都应用组织培养快速繁殖。2.2植物脱毒苗的制备脱毒苗培育主要集中于观赏植物。观赏植物受到病毒侵染后,品质下降,产量降低。长期无性繁殖的植物,在繁殖过程中病毒可通过营养体进行传递,逐代累积,使病毒病的为害更为严重。为消除病毒的为害,20世纪80年代人们就广泛采用了茎尖组培脱毒的方法。茎尖生长点通常没有或只有很少病毒,以茎尖为材料或加以适当的热处理,在无菌条件下培养即可获得脱毒植株,然后通过快繁得到大量无毒苗。脱毒后的植株生长势强,品质提高,产量增加,且能够保持品种的优良特性。目前,利用生物技术方法对植物脱毒苗进行组织培养和扩大繁殖,已被各国园艺界广泛应用。如张丕方针对香石竹(Dianthuscaryophyllus)、球根花卉、兰花(Cymbidium)等比较容易感染病毒病的问题,进行香石竹茎尖培养研究,使香石竹脱毒苗单位面积内平均花数增多,裂苞率减少,在提高切花质量的同时也提高了切花产量,解决了退化问题。袁梅芳等利用鸢尾(Iristectorum)茎尖(<1mm)进行组培,试管苗脱去了鸢尾重花叶病毒、鸢尾轻花叶病毒和水仙潜隐病毒。李昌禹等在MS培养基上附加5mg/L病毒唑培养唐菖蒲(Gladiolushybridus),再经38~40℃热处理,切取微茎尖2次,去除了为害唐菖蒲的3种主要病毒TMV、CMV和TVY。赵兰勇等利用茎尖培养有效脱除为害6个品种切花菊(Dendranthema)种苗的番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CBV)、菊花花叶病毒(CHMV)。可见我国的脱毒技术已取得了很大成就。2.3葡萄种的诱导诱导通过组织培养产生的体细胞无性系变异(常规育种中不可能出现的变异),为植物的品种改良和新品种的选育提供了新的途径。20世纪80年代以来,我国在作物无性系变异育种方面取得了令人鼓舞的进展,已培育出了一大批优良新品种。利用胚培养技术是育种研究中克服胚败育或发育不良,提高萌发率以及提早萌发,缩短童期的有效手段。Ramming提出把葡萄(Vtisvinifera)种子播在培养基上,置于1℃下冷藏45d,比切割胚更能促进发芽。李世诚提出了从未熟胚诱导产生胚状体的葡萄胚培养新途径。多倍体育种方面,王锦秀研究证明,利用愈伤组织进行枸杞(Lyciumchinensis)同源四倍体的诱导方法简便可靠、诱变频率高、效果好,是创造枸杞新种质、培育枸杞新品种的有效途径。曹孜义等将葡萄二倍体欧亚种‘Grenach’的花药接种在B5附加激素的培养基上,通过提高糖浓度和加倍盐浓度,首次从葡萄组培中获得三倍体葡萄等。原生质体培养在体细胞遗传的研究及育种上的应用都是十分有意义的,连勇等应用原生质体融合技术获得了茄子种间体细胞杂种等。此外,组织培养可为植物遗传转化提供理想的受体材料,是植物基因工程研究的基本条件和重要手段,在植物基因工程改良中发挥着重要作用。2.4种子工程利用营养地球上存在着丰富的植物种质资源库,对植物育种、生态系统的丰富稳定以及人类的可持续发展都是无价之宝。但是,这些物种的存在正受到越来越严重的多种威胁,许多濒临灭绝。而传统的种子保存,随着时间的推移,生活力下降,并常常受到病虫害的侵染。实地保存不但成本高,而且受到天灾毁灭的危险。而植物组织培养的成功,就可以将少量的芽、胚或茎尖保存在试管中,不仅节省成本,利用很小的空间就能安全地保存大量的物种基因,需要时随时取出大量繁殖,并且因为不带病毒和病原菌,可以将其在国际间进行交换,达到资源共享。陈维伦等研究了猕猴桃属(Actinidia)植物通过茎尖离体培养方法保存了10多个种,40多个猕猴桃品种的离体种质。刘翠云等用山梨醇(5~30mg/L)、甘露醇(5~30mg/L)和矮壮素(0.01~0.1mg/L)3种生长延缓剂加入到1/2B5+IAA0.2mg/L培养基中,进行葡萄种质离体保存,1a只继代转移2~3次即可。马锋旺等将杏(Prunusarmeniaca)茎段在附加2,4-D1.0mg/L和BA0.1mg/L的改良MS培养基中诱导出愈伤组织,放入DMSO10%+山梨醇或葡萄糖0.5mol/L的冰冻保护剂中,以1℃/min的降温速度降至-40℃,停留2h后可以较长期保存在-186℃的液态氮中。现在国内外正在研究冷冻贮藏植物细胞、组织、器官等。2.5组织培养药用植物高等植物中含有的药物、调味品及香料等天然成分,一直是人类生活不可缺少的,但很多的复合物人工还无法合成。随着生活水平的提高和疾病的复杂化,人们对这一类生物产品的需求越来越多;相反,由于野生资源的减少,环境的恶化,来自于高等植物的一些药物越来越不能满足需求,而组织培养过程中可产生这些有用的次生物。利用该特点,可以利用组织培养,用工厂化生产的方式,不受季节和地区限制地进行生产。如银杏(Ginkgobiloba)是原产我国的重要药用植物,主要含黄酮类和银杏内醋类等药用成分,由叶片提取药用成分受到含量低、提取工艺复杂、成本高等问题的限制,通过离体培养生产黄酮和银杏内脂近年取得了一定进展。刺果番荔枝中含有抗肿瘤活性的番荔素,并被证明还具有杀虫活性、细胞毒性、抗疟活性。赵沛基等进行了刺果番荔枝(Annonammuricata)的组织培养,为解决其快速繁殖以及为下一步开展次生代谢产物生物合成的研究提供了基础性资料。3木本观赏植物群的培育3.1木本观赏植物的离体培养木本观赏植物的组织培养始于60a前,法国学者Gautherct在1934年曾就树木组织培养进行过最早的研究。从20世纪80年代起,国外开始对木本观赏植物的组织培养进行了大量研究。Mathes利用三倍体美洲山杨(Populustremuloides)的茎作外植体培养出愈伤组织,并诱导出根和茎。木本观赏植物花药培养最早是波兰学者Zenkteler在灌木茄科植物滨藜叶枸杞(Lyciumhalimifolum)中获得成功的。我国对木本观赏植物离体培养工作始于20世纪70年代,最初集中在花药培养上,后来才发展到以体细胞组织为材料的离体培养。近年来,木本观赏植物原生质体游离、培养及融合的研究已涉及到近30个属。在这些研究绝大部分局限于原生质体游离的研究。在胚乳培养方面,迄今为止已有10多种木本观赏植物先后获得了胚乳植株,但均停留在愈伤组织、胚状体或只分化出根等阶段。以体细胞组织为材料的离体培养也取得了较大进展,对外植体的选用和高效培养基的改良应用都已达到一定水平。植物幼株的诱导也已在许多木本观赏植物上获得了成功。20世纪90年代应用组织培养技术进行离体快繁的木本观赏植物,主要分布在蔷薇科、豆科、木犀科、桑科、松科、杉科、牡丹科、鼠李科、大戟科、紫茉莉科和棕榈科等,近100种。常见的木本观赏植物大约有1000种,能通过组培快繁的种类约占总数的10%。可见,能通过组培快繁的树木种类还只有很少一部分。到目前为止,木本观赏植物的组织培养已经取得了重大进展。从裸子植物的苏铁、银杏、华北落叶松、西加云杉、侧柏等,到被子植物的桉树、连翘、广玉兰、金花茶、榆叶梅、合欢等,乃至禾本科唯一可以作为木本植物的竹子都有研究报道。许多稀有的植物种类,如阿月浑子、华腺萼木、四合木等也有研究。而且,一些优良树种如桉树、火炬树、樱花的离体快繁体系已经相当完善,已应用于苗木大规模生产中。3.2木本观赏植物植物再生体系的研究木本观赏植物的植株再生的研究通常包括外植体、培养基的选择和改进、激素和其他培养物的添加、植株再生及其他条件等方面。3.2.1采用外植体培养外植体的选择是组织培养中1个非常重要的问题。从理论上讲,植物细胞具有全能性,所以无论选用植物的哪一部分作外植体都能诱导成株。但是研究表明,1株树木的不同组织或部位在器官发生能力上有相当大的差别。木本观赏植物组培所用的外植体,通常是树木的幼年组织,如胚、子叶、实生苗嫩茎等。杨树的组织培养,多数是选用芽作外植体。Whitehead和Giles曾利用腋芽作为外植体培养3种杨树。Christie也应用大致同样的方法,成功地繁殖了银白杨、欧洲山杨、美洲山杨、灰杨及银白杨与腺杨的杂种。木本观赏植物的外植体初分化率一般较低,需要选择在生理活性旺盛的春季进行培养。傅萼辉等以梅花早春萌动的腋芽为外植体,在自制的WB培养基上,实现了梅花的离体快速繁殖。Fontanel等从银杏雌配子体中诱导胚状体的发生,指出诱导的最佳时期是授粉后8~10周。段祖安等用金脉连翘的母树嫩茎段作外植体诱导率高,分化增殖系数大。张进献等利用细叶连翘的茎和茎尖,成功地实现了细叶连翘的组织培养和快速繁殖。3.2.2采用不同的培养基选用适宜的培养基是组织培养成功的关键问题之一。根据不同的培养目的(诱导愈伤组织、不定芽、分化、生根),所选用的培养基亦应有所不同。用于木本观赏植物组培快繁的培养基有MS、WPM、SH、CM、改良的Nitsch等基本培养基,其中大多数采用的是经过改良的MS培养基。英国人Wolter改良了基本培养基,成功地诱导出美洲山杨的茎。Lioyp和Mccown在MS培养基的基础上,针对木本植物的特点,曾创出一种专门用于木本植物的培养基WPM(WoodyPlantMedium),其中许多成分较MS有一定的改变。Arrillaga等把刺槐子叶接种在木本培养基上,不仅芽长高,而且诱导出新芽。郑均宝等采用松科植物专用的NH培养基进行腊梅嫩茎段的离体快繁,获得成功。杜盛等在脱皮榆离体培养中,采用全量和大量减半的MS培养基2种无机盐浓度进行不定根诱导,结果表明,在丛生芽诱导时期全量MS培养基优于大量减半的MS培养基,但大量减半的MS培养基却利于不定根的诱导。3.2.3生长素的应用木本观赏植物组织培养中常用的植物激素有IAA、NAA、2,4-D等生长素,赤霉素GA,以及BA、KT、ZT等细胞分裂素。其中,BA、ZT和2,4-D多用于丛生芽或愈伤组织的增殖过程,IAA、NAA和IBA等多用于生根培养。有时还添加肌醇、环烷酸钠、LH、Vc、ABT等其他物质,以促进离体培养材料的生长发育。木本观赏植物组织培养中外植体的诱导及增殖不仅与植物生长调节剂的种类有关,而且还与它的组合及浓度有关。在观赏植物组培中,为避免发生变异,大多希望较少产生愈伤组织,能尽快出苗。因此,生长素用量宜适当控制。吴丽圆等以蓝桉的芽器官作为外植体,在2,4-D的作用下,经过脱分化过程较易引起染色体变异,而且愈伤组织多次继代培养后易丧失分化能力。田英翠等利用大叶惠兰的原球茎进行不同浓度激素和复合添加物对其影响的试验,结果表明,适当浓度的激素可以控制原球茎的发育方向,适当浓度的复合添加物可促其快速增殖。生长素对组培中外植体不定根的诱导有较显著的作用。通过对不同生长素作用效果差异的研究发现,多数种类中IBA不仅促进生根效果好,而且根的进一步生长较正常。在一些种类中,IAA和NAA也被广泛应用。一般认为,生长素在较低浓度对发根有利。细胞分裂素对组培中不定芽的分化及增殖有着显著作用,不同种类的细胞分裂素对不同的材料作用差异较大,但大多数种类以BA最为有效。汪景山等在山楂的组织培养中发现,低浓度的BA可促进不定芽的分化,提高浓度则产生丛生芽,并抑制节间生长;低浓度的ZT可促进芽的分化,但不及BA产生的芽多。细胞分类素对愈伤组织的形成也有明显作用。WooJH等认为在含有BA的MS培养基上,茎培养比其它器官培养产生较多的愈伤组织。刘鹏等在研究外源激素对七子花幼叶愈伤组织影响时发现,低浓度的ZT能有效地促进愈伤组织的分化与生长。木本观赏植物组织培养中,还经常加入其他的有机物。Civinova等在研究树