外植体褐化的发病机制及防治

外植体褐化的发病机制及防治

在植物组织培养中提到的黄褐色是指在外植体诱导初始分化或再分的过程中，自身组织从表面向培养基释放棕色物质，培养基逐渐转化为棕色，外植体随后褐死。褐化现象主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变，而且对许多酶有抑制作用，影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致材料死亡。褐化、污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题，且控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难，因此，有人认为，褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。1褐变的酶底物褐化分为酶促褐化和非酶促褐化。非酶促褐化是由于细胞受胁迫条件或其他不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而导致的褐化，其中未涉及到酚类物质的产生。酶促褐化是因为酚类物质的参与而引起的褐化现象。目前认为植物组织培养中的褐化主要是酶促褐化。酶促褐化必须具备酶、底物和氧3个条件。引起褐化的酶有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PLA）等，而目前普遍认可的诱发褐化的酶类是多酚氧化酶。PPO是一种含铜酶，它的活性依赖于铜的氧化还原作用。该酶适宜反应体系的pH范围为5.8～6.8，其不耐热，40℃以下活性稳定，45℃以上活性迅速下降。PPO可以催化2种不同的反应，即催化含1个羟基的酚形成二醌和催化邻苯二酚形成二醌。引起褐变的酶底物主要是酚类化合物，它是植物界中种类最多、分布最广的次生代谢物质之一。酚类物质的共同结构特点是含有带羟基的苯环结构，按其组成结构可分为苯基羧酸类（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等）、苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等）、黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等）三大类。酚类物质是一类有害的次生代谢产物，在植物细胞中能与蛋白质或酶发生氢键缔合，能与许多金属离子络合，其氧化产物醌在植物细胞内既能自我聚合，也能与含有羟基、氨基和巯基之类的化合物发生反应而产生有色物质，导致组织的褐变。酶和底物的深入研究已经为酶促反应体系理论的研究奠定了基础。Mayer在进行组织培养时发现，酚类物质的含量与其褐变率成正相关，提出了果实组织细胞中酚类物质和PPO的区域化分布假说，认为在正常发育的植物组织中，底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，这是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。当细胞膜的结构发生变化和破坏时，就为酶与PPO的接触创造了条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐化。鞠志国证实，莱阳梨细胞中的酚类物质集中于液泡，而PPO则主要分布于细胞质中，并且果实内总酚含量与其褐变密切相关。陈秀芳等在研究果实成熟过程中某些酚含量和PPO活性变化的关系时，证明了褐变程度与总酚含量以及PPO活性之间存在一定的关系，但因品种而异。而罗晓芳等的研究表明，多酚氧化酶的活性与组织培养材料的褐变不呈正相关，但酚类物质的总含量与褐变有一定的关系，同时易褐变材料的褐变程度随培养时间的延长不断增加。2外植体生理特性及成因引起组织培养过程中外植体褐变的因素包括2个方面：一是外植体自身的原因，包括外植体的生理状态、生长状态、遗传特性等；二是外植体所处的培养环境，包括培养基的成分及培养条件。2.1花药培养中愈伤组织的诱导在植物组织培养中，不同物种之间褐化程度差异很大，就是同种植物的不同品种间也存在一定差异。如橡胶树的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织诱导容易，而有些品系花药容易褐化，诱导困难；银杏的众多品系中，佛手品系比梅核品系愈伤组织诱导困难。这些可能是由于外植体的基因型差异引起的。2.2褐化、褐化材料的研究邱璐等研究发现，用桑树基部发出的幼芽作外植体比用上部壮枝上的壮芽作外植体褐化轻、褐化率低；幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低。Gannoun等报道，阿月浑子2年和4年生材料的组织培养获得成功，但8年和26年生材料则出现褐化现象。陈正华进行枇杷的微茎尖（1mm以下）培养时因酚类物质褐化死亡；在进行较大的茎尖培养时褐化现象会消失。Wang等报道，富士苹果和金华桃在9月到2月取材褐变轻，5月到8月取材褐变重。可见，外植体的选择对组织培养的成败至关重要。2.3组织培养中外植体的褐化过高的无机盐浓度会引起植物外植体的褐化，这在油棕和云桑的组织培养中得到了体现。芸苔属植物光照时间过长、光照强度过大都会使褐化现象变得严重，甘蔗胚性细胞在过强的光照（2500lx以上）下，细胞团表面容易褐变，弱光下则会出现绿色芽点。高温能促进酚类氧化，而低温可以抑制酚类化合物的合成，可以降低多酚氧化酶的活性，减少酚类氧化，从而减轻褐变。抗氧化剂对核桃、桑树和荔枝的组织培养中外植体的褐化程度影响很大。在水稻的体细胞培养中，pH为4.5～5.0的MS培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，而pH为5.5～6.0时，愈伤组织严重褐化。以上研究表明，除植物体的自身原因外，培养环境对褐化的影响也不容忽视。3防止棕榈树组织培养过程中，材料的褐化往往是多种因素共同作用的结果，抑制或降低组织培养中褐化的主要途径如下。3.1外植体的加工外植体组织的受伤害程度直接影响褐变的发生。Bonga等认为，外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐化的程度越大，这在巨桉和卡德兰的组织培养中得到了验证。Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养也很少发生褐变。因此，在切取外植体时，应尽可能减少其伤口面积，伤口剪切尽可能平整。切取外植体时还应考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切长些。3.2外植体的消毒处理预处理包括：流水冲洗、低温消毒、预培养等。对易褐变的材料经流水冲洗后放在2～5℃的低温下处理12～24h，经消毒处理后接种到只含有蔗糖和琼脂的培养基上培养5～7d，一方面使培养基中的酚类物质部分渗入培养基，另一方面使外植体伤口愈合，这样可使外植体褐化程度减轻。李丽梅等认为，预冷可减轻黄冠梨果皮褐变的发生率。3.3外植体防褐化能力组培中外植体的褐化是植物在一种逆境下的适应性反应，故此，在最适宜的培养条件下，外植体处于旺盛的生长状态，有较强的分生能力，便可大大减轻褐化。苹果M7使用1/2MS培养基可减轻褐化。卡德兰开始培养时，温度保持在15～20℃，培养基pH调至5.5，有助于减轻褐化的程度。3.4防控部曲子型向酚类物质褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO的抑制剂。黄浩等认为，水解乳蛋白的抗褐变原因，一方面是弱酸性物质与酚类的羟基作用形成酯类，减少了PPO作用底物的浓度；另一方面是水解乳蛋白竞争性地与底物结合的结果。亚硫酸盐可直接抑制酶，它与反应的中间体相互作用，阻止中间体参与反应形成褐色素，或作为还原剂促进了醌向酚的转变。此外，硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、氯化钠也是PPO的抑制剂。可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，用于防止褐化的发生。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附各种微量物质和微小颗粒，亦可用来防止组培中褐变的发生和发展。何琼英等在苦丁茶体细胞组织培养前，将苦丁茶茎段经常规消毒后，用可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP,2g/L）浸泡10～15min，并在培养基中加入活性炭（AC,1g/L），获得了较好的防褐效果。3.5外植体接种后转移将外植体很快转移到新鲜培养基上2～3次，在某些情况下可以缓解褐化，可能是在这段时间内外植体的切口逐渐愈合、外渗停止的原因。在兰花、无花果、核桃的组培中使用了这个方法，收到了良好效果。在外植体接种后的1～2d立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5～6次可基本解决外植体的褐变问题。此法比较经济简单，应是克服褐变的首选方法。但是工作量较大。4褐化的生理作用在植物组织培养中，引起褐化的因素是复杂的，既有培养物自身的原因，也有培养环境的影响，而且往往是多种因素同时作用的结果。因此，深入了解有关机制是从理论上认识组织培养中的褐化现象、找到影响褐变的主导因子和克服褐变的有效方法，并可从实践上防止褐化的发生，这对解决组织培养生产中的褐化这一难题、促进组织培养技术的日臻完善具有重要的理论和现实意义。酶促褐变存在着不同物种间的基因型差异，因此对褐化较