造血系统恶性疾病合并造血常见的造血意义

造血系统恶性疾病合并造血常见的造血意义

针对血液系统疾病的恶性疾病、恶性淋巴结和再生障碍缺血性红细胞的患者，以及由化疗和放疗引起的中性细胞缺如和吞咽细胞功能障碍的药物使用的大量广福抗生素，导致假单胞菌病和双重感染的病例逐年增多。败血症是血液病特别是恶性血液病常见的医院感染。败血症是一类因多种病原菌进入机体血液系统后迅速繁殖、产生大量毒素,激发机体免疫系统产生的过度炎症性反应,致死率极高。如何深入认识败血症的发病机制,并寻求相应的干预策略是败血症研究的重点及难点。败血症发病机理的研究主要得益于多种动物模型的建立。动物模型的建立一方面要有良好的稳定性、可重复性,最重要的是要能很好地模拟临床败血症的病理过程。在众多败血症动物模型中,盲肠结扎穿孔模型(ceacalligationandpuncture,CLP)应用较多,但目前尚缺乏规范、统一的操作步骤及评价标准。为了更好地将这一模型用于败血症防治研究,我们在多次重复实验的基础上,探索了一种成熟、稳定的败血症模型制备方法。同时为了验证我们制备的模型与临床败血症的一致性,我们还从动物整体死亡率,体重变化,炎性因子C5a、IL-6、TNF-α、IFN-γ等变化,胸腺淋巴细胞及肠系膜淋巴细胞凋亡情况,胸腺及脾组织病理变化等不同方面对我们的动物模型进行了评价。材料和方法6-8周龄雄性C57小鼠购于本院实验动物中心,于本院普通级动物房饲养。检测试剂和检测方法淋巴细胞凋亡检测试剂盒购于北京精美生物技术公司。C5aELISA检测试剂盒购于PharMingen公司。IL-6、TNF-α、IFN-γELISA检测试剂盒购于eBioscience公司。PE标记抗小鼠CD4+抗体购于eBioscience公司。速眠新及氯氨酮购于福建吉田制药有限公司。抗凝剂(ACD)购于Baxter.Deerfield公司。手术刀片、剪刀、8号注射器针头购于北京京鹿手术器械有限公司,缝合线、缝合针、结扎线购于上海医用缝合针厂有限公司。麻醉温度的确定将氯氨酮、速眠新、生理盐水按2∶1.5∶3.5体积比,混合均匀后于4℃条件下冷藏,C57小鼠麻醉剂量为0.05毫升/只,选用腹腔注射法进行麻醉。盲肠远端部位联合穿刺C57小鼠麻醉后仰卧于手术台上固定,75%酒精消毒腹部,剑突下一指沿腹白线用手术刀打开约2-3cm切口。暴露腹部、找到盲肠部位,以3-0号丝线结扎盲肠远端部位,结扎2/3宽度,并用8号针头穿刺肠壁2次,挤出适量肠内容物,将肠内容物及盲肠按原位放回腹腔,逐层关腹,分别缝合结扎。假手术组同样需暴露肠内容物,但不进行肠结扎及穿孔操作。抗凝处理手术后不同时间点将C57小鼠进行眼球放血,分别收集血清及血浆,血浆ACD进行抗凝处理,血液与ACD比为9∶1。样品收集后室温条件下5000rpm离心10分钟,吸取上层血清及血浆,于-80℃保存备用。fcs/pbs包的制备C5a、IFN-γ、IL-6和TNF-α的检测依据细胞因子检测试剂盒说明书。一抗(1-5μg/ml)溶解于包被液(碳酸盐缓冲液pH9.6),100μl/well包被ELISA亲和96孔板,4℃放置过夜后,10%FCS/PBS封闭2小时。用PBS-T洗板3次,加入100μl/well样品(1∶10-1∶100稀释),室温放置1小时,用PBS-T洗板3次,加入Biotin化抗体(1-5μg/ml),室温放置1小时,用PBS-T洗5次,加入Avidin-HRP(1∶1000稀释,100μl/well)室温放置半小时,以OPD或TMB显色系统显色,测OD492或OD450值,根据标准曲线确定细胞因子水平。facs液制备手术18-20小时后动物进入炎症反应的急性期。C57小鼠眼球放血后脱臼处死,分离胸腺组织及肠系膜淋巴结,组织研磨后滤网过滤去除组织碎片,细胞用FACS液洗2次备用。首先标记PE标记的CD4+抗体,随后按凋亡检测试剂盒说明书标记FITC标记的AnnexinⅤ抗体,细胞染色完成后立即用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。胸腺及脾组织病理学检测CLP术后20-24小时用颈椎脱臼法或眼球放血法将C57小鼠处死,钝性分离胸腺组织及脾组织,组织分块切割后置于10%福尔马林液中固定,经脱水包埋处理后,制作石蜡切片,切片厚3-5um,HE染色,在光学显微镜下观察胸腺及脾组织病变情况。动物生存率的相关性成组设计资料均数或有一个重复变量的两因素设计的T检验,Kaplan-Meier统计分析方法比较两组动物的生存率,p﹤0.05被认为有显著性差异。结果对于动物的脏器黏连情况,一般认为是说外观上的动物,只是细胞更新检测结果显示,随着急性炎症的进一步恶化,70%-80%的动物于术后72小时内死亡,在限定的观察时间内只有20%左右动物生存(图1A),而存活下来的动物消化系统脏器黏连严重,腹腔会形成较大范围囊肿。因囊肿形成及消化系统功能受损,动物体重减轻,CLP手术组与对照组动物体重比较降低明显(图1B,p<0.05)。炎症介质及介质C5a,IL-6,TNF-α,IFN-γ是与败血症相关的重要炎症介质。用ELISA法对CLP手术后不同时间点检测结果表明,补体C5a(图2A)、IL-6(图2B)、TNF-α(图2C)、IFN-γ(图2D)等在CLP手术后表达均为显著的上调。cd4+淋巴细胞凋亡率检测CLP术后20小时分离小鼠的胸腺和肠系膜并用流式细胞术方法检测CD4+淋巴细胞的凋亡率。结果显示,CLP组小鼠与对照组小鼠相比,胸腺(图3A)及肠系膜(图3B)的CD4+淋巴细胞均出现了明显凋亡。红染、脾组织检测我们于手术的急性期后(20小时)分别取胸腺组织及脾组织进行HE染色观察。结果显示,胸腺皮质下充满大量细胞碎片,细胞核出现红染(图4A)。脾组织表现组织肿大,被膜外有大量纤维及炎性细胞渗出;渗出细胞以中性粒细胞为主,核为分叶核;红髓范围扩大内含粒细胞及淋巴细胞,脾窦充满大量红细胞(图4B)。从临床转染的角度表达模型造血系统恶性疾病患者由于其疾病特点及化疗药物的应用,机体免疫功能低下,粒细胞减少甚至缺乏,极易受病原微生物的侵袭致医院感染性败血症,使得近年来败血症的发生逐年增多,败血症早期诊断困难,死亡率居高不下,严重影响了血液系统疾病的治疗效果。为此我们成功建立了败血症的小鼠模型,为医院感染性败血症的研究提供了良好的实验平台。败血症是一类由局部感染病原菌而最终导致机体发生全身系统性反应的炎症性疾病,主要表现为:高水平炎性细胞因子产生,淋巴细胞大量凋亡,多种脏器(脾脏、心脏、肺脏、肝脏、心脏)出现病理性破坏。目前临床研究中针对败血症的各种治疗尚未取得良好疗效,主要原因是发病机理不清楚,病原菌大量入侵导致免疫防御功能受损,而防御功能受损进一步加重机体的感染损伤,多种因素互为因果导致最终全身脏器功能衰竭。为了能找到各类炎性细胞因子及参与炎性反应的各种细胞之间的调控关系,首先需要我们建立一种简单、可靠的动物模型。人们对败血症的研究主要得益于多种动物模型的建立,主要包括3类:①直接注射外源毒素例如LPS、内毒素、zymozen等;②直接静脉或腹腔注射活体病原菌例如细菌真菌等;③破坏动物自身的保护机制,让细菌等肠内容物外漏、移位。目前为止,常用的模型是盲肠结扎穿孔模型。Huber-Lang等早在20世纪70年代就建立了该模型,经过多年的研究论证,已经证明CLP模型从血液动力学及细胞因子变化等方面与人极为相似,为研究败血症的发病机理提供了良好工具,也是应用最广泛的模型之一。我们以规范的盲肠结扎穿孔模型(CLP)来模拟临床败血症的病理变化。两者除了同时存在多种病原菌的混合感染外,还具有一致的炎症反应过程,即败血症发病初期,炎症系统被广泛激活,免疫细胞损伤(凋亡)及组织器官的病理学改变等。为了观察盲肠结扎穿孔(CLP)手术对小鼠整体状况的影响,我们首先观察了CLP术后动物的整体生存状况,实验小鼠表现为:毛发枯槁、活动能力弱、身体脱水、呈恶性消耗型体质。结果显示,CLP术后动物整体生存水平(20%左右)与文献报道相符合,实验重复性较好,可以应用该模型进行发病机理研究。败血症是机体的系统性炎症反应,过度的免疫应答反应导致各细胞因子之间的相互调控关系受到破坏,免疫平衡出现紊乱。为了观察我们的模型是否存在炎症介质大量释放等免疫紊乱状况,本研究对CLP手术后一些炎症介质如C5a、IL-6、TNF-α、IFN-γ等的变化进行了检测。本实验结果显示CLP手术后有大量炎症介质的释放,表明我们的模型能很好地模拟临床败血症的免疫紊乱现象。败血症发病初期,炎症系统被广泛激活,其中包括体液和细胞两部分防御系统。各类炎性因子及细菌的直接破坏作用使得大量淋巴细胞发生凋亡,出现免疫抑制状态,其中发生凋亡的淋巴细胞主要是B淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞;淋巴细胞的凋亡使机体产生抗体、活化巨噬细胞的功能受到影响,阻碍了病原菌的及时清除,是机体免疫功能受损的基础,也是导致多器官功能衰竭的重要因素。本研究也观察到了CLP手术后淋巴细胞大量凋亡的现象。临床研究发现,败血症发生后多数病人因不能将体内病原菌、各类毒素清除,会出现多器官功能衰竭。为了进一步验证败血症发生后机体各脏器生理功能受损的物质基础,我们对手术后的急性期(20小时)的胸腺和