梅毒螺旋体的检测方法及评价

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梅毒螺旋体(treponemapallidum,TP)是引起性传播性疾病梅毒的主要病原体。19由Schandim等首次发现,经过人类粘膜或有破损的皮肤直接接触病人感染性病灶而传播。不但引起人类全身性疾病危害人们的健康,同时还传播给下一代。多年来经过大量的研究工作,建立了许多检测TP的方法。近年来,随着分子生物学和免疫学技术的发展,进一步促进了对TP的研究工作,使得快速、敏感、特异的梅毒诊断方法不断更新完善,有利于广泛开展流行病学调查、预防控制及更准确地指导临床治疗。

TP检测的各种方法

检测TP和抗-TP抗体的方法有梅毒螺旋体检查和血清学检查法。梅毒螺旋体检查主要包括暗视野显微镜检查、直接免疫荧光实验（ＤＦＡ）及梅毒螺旋体镀银染色检查,其中ＤＦＡ的特异性较高。梅毒螺旋体检查适用于一、二期梅毒有病损者的患者，受取材及特殊显微镜限制，耗时长,难以为临床所接受。

血清学试验是当前国内外诊断梅毒的主要方法,其种类较多,包括非螺旋体抗原试验(非特异性试验)和螺旋体抗原试验(特异性试验)。

非特异性试验是以类脂质为抗原的试验方法,世界卫生组织确认诊断梅毒的标准试验有

1性病研究实验室(VDRL)试验;

2不加热血清反应素(USR)实验;

3快速血浆反应素(RPR)试验;

4自动反应素(ART)试验;

5RST反应素筛选试验和TRUSAT(甲苯胺红不加热血清试验)。这些试验因具有相同的标准化抗原,敏感性相似,对1、2期梅毒有诊断价值,也可做疗效随访用。又因其操作简易,费用低廉,常见作梅毒的筛选检查。但它们的敏感性和特异性比特异试验差,而且生物学假阳性高,结果受多种条件的影响。除对其它螺旋体感染时出现阳性外,假阳性还出现在急、慢性感染,妊娠,高丙种球蛋白血症,结缔组织病,溶血性贫血和其它自身免疫性疾病,也可出现在老年人和一些健康人,但多数情况下查不出原因。在国外上述几种非特异性试验中,除VDRL试验常见外,RPR试验和ART应用较少。

在中国多用RPR和TRUST。就TRUST、RPR两种方法而言,对非特异性反应素抗体导致的阳性标本TRUST法的检出率和重复性都强于RPR法,这可能与TRUST试剂中表面包裹抗原的甲苯胺红颗粒比RPR试剂中的活性炭颗粒小更易耐受振荡导致TRUST试剂稳定性强有关。

特异性试验是以梅毒密螺旋体本身或非致病的密螺旋体为抗原,以检查病人血清中抗密螺旋体的特异性抗体。当前应用的方法有:

1密螺旋体荧光抗体吸收(FTA-ABS)试验;FTA-ABS试验被认为是当前敏感性和特异性最高的试验方法,且在1期梅毒头几天就能够测出特异性抗体F3G，常见来最后确诊梅毒,在研究中以它为标准。但提取物为活菌，存在潜在危险性，故其应用受到很大限制。FAT-ABS试验是定性试验,治疗对它的影响也很小,一般用于确诊而不用于筛选。

2梅毒密螺旋体血凝(TPHA)试验;TPHA试验容易操作和定量,特异性高,但试剂昂贵和不易标准化,偶然发生生物学假阳性。

经过对国内文献回顾发现，近年来TPHA已成为对除FTA-ABS以外的其它实验的“金标准”。

3蛋白印迹试验;免疫印迹法检测梅毒特异性抗体敏感度等于或高于其它三种同类方法,特异性与ELISA和TPPA两种方法相同,但显著高于FTA-ABS法(92.2%)。免疫印迹法敏感度高,特异性好,操作简单,不需特殊仪器设备,阴阳性结果界线分明,易于判断,适应于临床广泛开展。

蛋白印迹试验结合了免疫学和分子生物学的特点,敏感性高,特异性强。

4酶联免疫吸附(ELISA)试验;ELISA法采用抗原包被,用过氧化物酶标记并进行酶反应,是一种较新的梅毒诊断血清学方法。用抗梅毒特异性抗体ELISA试剂盒检测梅毒抗体,第一代试剂原理为间接法,采用梅毒抗原包被在酶标板上,以辣根过氧化酶标记物的抗人-IgG为第二抗体,测定梅毒感染的特异性抗体,据报道ELISA法对梅毒感染的整体敏感性达98%以上,特异性达99%,可与TPHA,FTA-ABS试验媲美。但梅毒患者血清存在IgG、IgM二种抗体，应同时检测，以提高敏感度。国外有报道：ELISAIgG敏感性一期梅毒为82%，其余各阶段均为100%，假阳性1.5%；

ELISAIgM阳性率一期梅毒为94%，二期梅毒为85%，早期潜伏梅毒为82%。因此认为分别作ELISAIgM和ELISAIgG是确诊梅毒的一种有效而简单的方法。国内有人同时检测特异性IgG和IgM抗体，其阳性率分别为一期梅毒93.8%，二期梅毒100%（IgG/IgM抗体试剂由意大利Sorindiagnosticss.r.i公司提供）。

第二代抗TP-ELISA试剂使用双抗体夹心法，主要是用基因重组表示抗原,包括梅毒螺旋体4种膜抗原,然后进行混合使用。用ELISA方法检测,实验结果与TPHA的总符合率为993%,且此方法操作简便,一次可完成多份标本的检测,试验结果由仪器分析,客观而准确。

现在的梅毒抗体诊断试剂将各区优势抗原连接成一个多表位的嵌合抗原,这样表示的多表位抗原即可满足诊断试剂的需要,大大提高了检测试剂的灵敏度。随着抗原表位的增多,检测的灵敏度也随之提高。以Ｔｐ15174247的四合一重组抗原为基础的诊断试剂是用于抗ＴｐＥＬＩＳＡ最理想的多表位抗原。

但有的TP-ELISA试剂,该试剂盒质量差，有文献报道兰州生物制品研究所的梅毒螺旋体特异性抗体酶标目测试剂盒与TPHA对比试验,二者符合率45.5%,35例梅毒血清中仅6例呈TP-ELISA阳性,其阳性检出率为17.1%。此6例TP-ELISA阳性者的TPHA结果,滴度均在1∶160以上,而TPHA1∶80阳性者无一例TP-ELISA阳性。敏感性极差。

有研究表明:用免疫印迹法、荧光梅毒螺旋体抗体吸附实验(FTA-ABS)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和梅毒螺旋体被动明胶颗粒凝集实验(TPPA)四种方法结果相比较。结果44例未经治疗的梅四种方法检测治疗前后梅毒患者结果一致性分别为100%和92.8%,四种方法检测梅毒的敏感度分别为100%,98.3%,98.3%,100%,经卡方检验,四种方法检测敏感度差异无显著性意义(P>0.05)。

5聚合酶链反应(PCR)试验。

PCR法是当前最先进的检验技术之一,直接检测TP的DNA物质,敏感特异,但PCR方法在普通实验室操作中容易造成PCR污染,且仅用于检测病原,故并不能取代梅毒血清学检测方法。

6胶体金免疫层析法（GICA）、金标免疫斑点法（DIFA）。

使用胶体金作为标记物的一种固相膜免疫测定方法,检测梅毒特异性抗体,采用了双抗夹心法。二期梅毒、三期梅毒、晚期潜伏梅毒的阳性试验符合率为100%,在一期梅毒中的敏感度为80%～85%,对早期梅毒的敏感性均较差。各检测方法在临床上的使用

TP检验方法的应用由于当前已获得特异性抗原的基因工程重组蛋白的纯制品,使得当前对梅毒的诊断仍能以血清学试验为可靠的依据,但因试用于临床诊断时间尚短,仍应结合病史和全面地体格检查,而做出诊断。

筛选应用一般认为感染梅毒后可检出阳性结果的试验顺序一般是FTA-ABS试验→非特异性试验→TPHA试验,但在以早期诊断为目的情况下,能够几种方法同时进行,常见的是一种或两种非特异性试验和一种特异性试验联合检查,一般选用VDRL和RPR试验与TPHA试验配合应用。

证实试验应用使用FTA-ABS试验。由于血凝法技术的进展,如MHA-TP试验也可用于确诊,但其敏感性介于非特异性试验和FTA-ABS试验之间。

ELISA也有可作为梅毒的确诊试验。观察病情和治疗反应的作用早期梅毒经治疗后,非特异性的反应素滴度一般下降很快,特异性试验中FTA-ABS试验的阳性反应(不能观察滴度的变化)可保留一段时间

而在TPHA试验虽然病人经过充分治疗并显示临床上的成功,但试验的阳性反应仍能持续相当长时间,甚至终身阳性。

免疫印迹技术和PCR诊断有症状的先天性梅毒时,具有高度敏感性和特异性,但对无症状的婴儿诊断时需慎重,应考虑存在非特异性的抗体反应。PCR可取代RST作为诊断先天性及神经性梅毒常见方法。

综上所述，对血清学试验选择，首选应选用TPHA、TPPA法进行过筛试验，阳性者用PST-ABS等法作确认试验。RPR、TRUST可将标本进行稀释进行半定量试验，能够作为疗效评价及判断是否再次感染试验。。ELISAS应作IgG、IgM抗体检测以提高敏感度。ICKD、

LCMD法假阴、阳性多，但方法简单、快速，可作为普查用。

梅毒诊断一度仅依赖于暗视野显微镜检查和敏感性、特异性均低的一般血清学试验。随着分子生物学技术发展,聚合酶链反应和免疫印迹技术为梅毒的诊断提供了新的检测手段。特别是在早期梅毒、先天性及神经性梅毒诊断中显示了较高的敏感性和较强的特异性。梅毒诊断方法的发展和完善,有利于指导临床及时治疗。

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