硕世手足口试剂性能验证报告

江苏硕世生物公司手足口试剂性能验证报告试剂名称：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型和肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）试剂厂家：江苏硕世生物科技股份有限公司仪器名称：实时荧光定量PCR仪型号规格：ABI7500实验地点：长沙金域检验中心实验时间：2017.9.6一、性能验证实验方案精密度实验：选择中值阳性样本，同一批次内重复检测临床样本，测试20次，统计Ct值，进行批内精密度验证，需满足CV<3/5TEa。临床特异性、敏感度实验：选取EVU、EV71、CA16临床样本，选取20例阳性-敏感度；选取20例阴性-特异性；要求特异性和敏感度均为100%。测定下限实验：选取EVU、EV71和CA16阳性样本，进行倍比稀释，稀释至Ct为36左右，验证检测下限是否与说明书相符。防污染实验：取高浓度样本20例与阴性标本20例组成梅花桩试验，结果应确保阳性样本检出率为100%，阴性样本检出率为0%。抗干扰实验：选取临床阳性样本，每个项目分别加入溶血阳性样本、UU阳性样本、ST阳性样本、CT阳性样本进行扩增，验证是否存在干扰情况。在满足方法学验证的前提下，最终确定具体验证方案如下：精密度符合率检测下限防污染抗干扰CA16/EVU10个重复20例阳性，20例阴性6个浓度，两个重复20个阳性20个阴性4个干扰，一个对照EV71/EVU10个重复性能验证实验结果及分析（一）精密度测试批内精密度扩增曲线图1批内精密度EV71项目扩增曲线图2批内精密度EVU(EV71)项目扩增曲线图3批内精密度CA16项目扩增曲线图4批内精密度EVU(CA16)项目扩增曲线注：手足口试剂在CA16或EV71阳性的情况下，EVU也会是阳性。图2批内精密度EVU(EV71)项目扩增曲线代表的是EV71阳性样本下EVU的曲线图4批内精密度EVU(CA16)项目扩增曲线代表的是CA16阳性样本下EVU的曲线CA16：柯萨奇病毒A16型EV71：肠道病毒71型EVU：肠道病毒通用型实验数据及评价批内精密度EV71EVU(EV71)CA16EVU(CA16)编号测定结果编号测定结果编号测定结果编号测定结果129.53128.22137.15136.24229.56228.26236.92237.38329.52328.35336.95337.87429.45428.24437.04436.86529.62528.48536.31536.71629.83628.49637.34636.91729.42728.16736.81736.94829.67828.43837.13836.83929.64928.60937.06936.661029.601028.431038.271037.47Mean29.584Mean28.366Mean37.098Mean36.987SD0.118SD0.142SD0.494SD0.466CV0.40%CV0.50%CV1.33%CV1.26%TEa7.5%Tea7.5%TEa7.5%TEa7.5%3/5TEa0.40%<4.5%3/5Tea0.50%<4.5%3/5TEa1.33%<4.5%3/5TEa1.26%<4.5%结论：分别选择CA16和EV71中值阳性样本，同一批次内重复检测临床样本，测试10次，统计Ct值，进行批内精密度验证，需满足CV<3/5TEa。通过统计计算得出三个项目批内精密度的CV值均小于3/5TEa（4.5%），均符合要求。（二）临床特异性、敏感度实验数据统计选取EVU、EV71和CA16临床样本，选取20例阳性-敏感度；选取20例阴性-特异性；要求特异性和敏感度均为100%。编号结果编号结果编号结果编号结果编号结果1CA16+9－17CA16+25－33CA16+2－10CA16+18－26EV71+34－3CA16+11－19EV71+27－35CA16+4－12－20－28EV71+36－5EVU+13－21CA16+29－37CA16+6－14EV71+22－30CA16+38－7CA16+15－23EV71+31－39EV71+8－16CA16+24－32CA16+40－结论：选取EVU、EV71和CA16临床样本40例，其中阴性样本20例，阳性样本20例，提取完核酸后，采取阴阳间隔的方式点样。检测结果与样本结果完全相符，计算结果均符合：临床特异性=[20/（20+1）]*100%=95%；临床敏感度=[20/（19+0）]*100%=100%（三）测定下限试验扩增曲线图5EV71项目梯度稀释扩增曲线图6EVU(EV71)项目梯度稀释扩增曲线图7CA16项目梯度稀释扩增曲线图8EVU(CA16)项目梯度稀释扩增曲线实验数据统计：取EV71和CA16阳性样本，进行10倍比稀释，向下稀释5个梯度，验证检测下限是否与说明书相符项目原样本结果稀释10倍结果稀释100倍结果稀释1000倍结果稀释10000倍结果稀释100000倍结果EV7127.2932.4236.1540.2041.91Undet27.5932.5635.9940.20UndetUndet均值27.4432.4936.0740.2041.91阴性EVU(EV71)25.9830.9334.7139.2240.02Undet26.1130.9035.0539.04UndetUndet均值26.0530.9234,.8839.1340.02阴性CA1623.7027.9431.3535.5238.71Undet24.0428.0631.4135.8238.8541.74均值23.8728.0031.3835.6738.7841.74EVU(CA16)22.3426.4129.6133.7336.79Undet22.3626.1429.5233.6537.5439.77均值22.3534.2829.5733.6937.1739.77结论：试剂盒说明书EVU测定下限Ct值为<35.5，EV71测定下限Ct值为<35.3，CA16测定下限Ct值为<35.3时报告阳性，本次对EVU、EV71、CA16阳性样本进行梯度稀释最低检测出结果分别为35.05、36.07、35.67，符合说明书规定的阳性样本最低检出限。（四）防污染结果统计：取高浓度阳性样本20例与阴性标本20例间隔点样，组成梅花桩试验，结果应确保阳性样本检出率为100%，阴性样本检出率为0%。手足口项目防污染验证结果情况结果结果结果结果结果ACA16+－CA16+－CA16+B－CA16+－EV71+－CCA16+－EV71+－CA16+D－－－EV71+－EEVU+－CA16+－CA16+F－EV71+－CA16+－GCA16+－EV71+－EV71+H－CA16+－CA16+－注：阴阳间隔点样，梅花桩分布。结论：本次实验检测结果显示19例阳性检出率(19/19)*100%=100%，21例阴性样本检出率为(0/21)*100%=0%，符合预期结果。（五）抗干扰实验实验数据及评价：项目生理盐水溶血样本CT样本ST样本UU样本EV7126.2827.4428.0227.5326.57EVU（EV71）26.7228.1227.9727.8226.71CA1627