食品微生物检验基本技术-菌种保藏

微生物菌种保藏技术目录/Contents01常规保藏方法菌种保藏方法真空冷冻干燥保藏方法0201常规保藏方法

1、菌种保藏的目的存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。01常规保藏方法

1.斜面保藏法

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2～4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。

此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易变异、易被污染。01常规保藏方法2.液体石蜡保藏法

将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1～2年，普通细菌也可保藏1年左右。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种，还可防止干燥，缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。01常规保藏方法处理液体石蜡：将液体石蜡分装于二角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，接着检查是否彻底无菌，即接入肉汤中检查有无杂菌生长。然后放在40℃温箱中，使水分蒸发掉，备用。加石蜡油：用灭菌吸管在无菌操作下将5mL石蜡油注入到已长好菌的斜面上，加入的量以超过斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。保藏：石蜡油封存后，将试管直立，放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。01常规保藏方法

穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。02沙土保藏方法沙土保藏法①制作沙土管

②灭菌加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。③制备菌液取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中,用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。④加样用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管,再用接种环拌匀。⑤干燥把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气,使之干燥。⑥保藏干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。02真空冷冻干燥保藏方法真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。

02真空冷冻干燥保藏方法操作流程准备安瓶管准备脱脂乳准备菌种制备菌悬液分装样品冷冻真空干燥封管存活性检测保藏活化02真空冷冻干燥保藏方法（1）准备安瓿管

用于冷冻干燥菌种保藏的管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，也称泪滴形管。安瓶管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。将标签放入安瓿管内，管口塞上棉花，121℃灭菌30min，备用。02真空冷冻干燥保藏方法（2）制备脱脂乳用鲜乳经处理或使用脱脂乳粉配兑脱脂牛乳，灭菌，并做无菌试验后备用。（3）准备菌种

所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24～48h的培养物；酵母需培养3天；放线菌与丝状真菌则培养7～10天。02真空冷冻干燥保藏方法（4）制备菌悬液

将脱脂牛乳2mL左右直接加到待保藏的菌种斜面试管中，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛乳内成悬浮液。（5）分装样品

用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓶管底部，每支安瓶管的装量约为0.9mL（一般装入量为安瓶管球部体积的1/3）。

（6）冷冻将分装好的安瓶管放在低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓶管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰。02真空冷冻干燥保藏方法（7）真空干燥（8）封管（9）存活性检测抽取一管进行存活性检查。（10）保藏一般4℃