食品微生物检测技术基础-微生物制片与染色方法

革兰氏染色法革兰氏染色原理一操作步骤与要求二目录页革兰氏染色法一、革兰氏染色原理是根据细菌细胞壁结构的不同而进行的染色方法。G+菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，番红复染后呈红色。革兰氏染色法一、革兰氏染色原理肽聚糖磷壁酸GˉG+过渡页操作步骤与要求二1.涂片、干燥、固定2.初染、水洗3.媒染、水洗4.脱色、水洗5.复染、水洗6.干燥、镜检革兰氏染色法二、操作步骤与要求1.涂片、干燥、固定载玻片滴水→拿试管、松棉塞→灼烧接种环→拔棉塞→取菌→塞棉塞→涂布→灼烧接种环→干燥→固定革兰氏染色法二、操作步骤与要求2.初染、水洗在固定好的涂面上滴加适量草酸铵结晶紫染液，染1min。倾去染液，流水冲洗至无紫色。革兰氏染色法二、操作步骤与要求3.媒染、水洗滴加卢戈氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟。倾去碘液，流水冲洗。革兰氏染色法二、操作步骤与要求4.脱色将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即用流水冲洗。革兰氏染色法二、操作步骤与要求5.复染、水洗滴加番红（或沙黄）染色液，染1~3min。用水洗去涂片上的番红染色液。自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。革兰氏染色法二、操作步骤与要求6.干燥、镜检将涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。在显微镜下进行观察。染色目的、原理及方法染色目的一染色原理二染色方法三目录页染色目的、原理及方法一、染色目的染色目的：一般活的微生物细胞含水量都在80%~90%，因此细胞对光的吸收和反射与水溶液相差不大，在普通的光学显微镜下不易识别，经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。染色目的、原理及方法二、染色原理染色过程除了受上述因素影响外，还受细胞通透性、培养基组成、菌龄、染色液中的电解质含量、pH、温度、药物作用等因素的影响。物理因素：染料通过毛细现象、渗透作用、吸附作用等物理方式渗入细胞。化学因素：细胞物质和染料的不同性质而发生的化学变化，从而使细胞着色，而且颜色较为稳定。染色原理：染色目的、原理及方法三、染色方法染色方法：细菌染色法死菌活菌:用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑）等作活菌染色正染色负染色：荚膜染色法等简单染色法复合染色法革兰氏染色法抗酸性染色法芽孢染色法吉姆萨氏染色法染色目的、原理及方法三、染色方法1.活菌染色：活体染色就是用对微生物无毒性的染料，如美蓝、刚果红、中性红等，配成一定浓度，再与一定量的菌液混合，经一段时间后，死菌和活菌会呈现出不同的颜色，这样便可在显微镜下区分开来。染色目的、原理及方法三、染色方法2.正染色：利用染料与细胞组分结合而进行的染色过程。分为简单染色和复合染色两种。单染色法：只用一种染料对细菌着色。手续简便，但一般只能显示菌体的形态，功能较单一。复染色法：使用两种或两种以上的染料对细菌染色。除了着色增加反差外，还可以对微生物种类等做出初步判断。染色目的、原理及方法三、染色方法3.负染色：与正染色正好相反，细胞不染色而使背景染色，以便看清细胞的轮廓。这种染料不能与细胞组分结合，为不透明燃料，如印度墨水、碳素墨水等。

水浸片法制片技术水浸片法定义一水浸片法操作步骤与要求二目录页水浸片法制片技术一、水浸片法定义定义：水浸片法又称压滴法，是将欲观察微生物置于载玻片上的水滴或染色液中，然后盖上盖玻片而制成微生物标本片的一种制片方法。过渡页水浸片法操作步骤与要求二1.滴染色液2.取菌3.染色4.加盖玻片水浸片法制片技术二、水浸片法操作步骤与要求1.滴染色液取洁净的载玻片，平放在操作台上，在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液（或蒸馏水）。水浸片法制片技术二、划线培养物涂片法2.取菌拿平板→拿接种针→灼烧接种针→平皿过火→掀皿盖→取菌

浸洗←平皿过火水浸片法制片技术二、划线培养物涂片法3.染色左手拿起放有染色液的载玻片，将菌体放于载玻片上染液中，用接种针小心的将菌丝分散开（尽可能保持霉菌自然生长状态）。灼烧接种针。水浸片法制片技术二、划线培养物涂片法4.加盖玻片取洁净盖玻片，先将盖玻片一端与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放在染色液上，盖玻片不宜平放和移动，尽量避免产生气泡影响观察。

涂片法制片技术涂片法定义一划线固体培养物涂片法二

菌悬液或液体培养物直接涂片法三目录页涂片法制片技术一、涂片法定义定义：将少量待观察微生物直接涂布在载玻片上制成微生物标本片的方法称为涂片法。过渡页划线固体培养物涂片法二1.滴生理盐水2.取菌3.涂片4.干燥、固定、染色等涂片法制片技术二、划线固体培养物涂片法1.滴生理盐水取一洁净载玻片，在载玻片中央滴一滴无菌生理盐水（或蒸馏水）。涂片法制片技术二、划线固体培养物涂片法2.取菌拿试管→松棉塞→拿接种环→烧接种环→拔棉塞→管口过火→取菌

塞棉塞←棉塞过火←管口过火涂片法制片技术二、划线固体培养物涂片法3.涂布左手拿起载玻片，右手用接种环把所取菌在生理盐水（蒸馏水）中涂成直径约1cm的薄膜状。涂片法制片技术二、划线固体培养物涂片法4.干燥、固定、染色等将涂片自然干燥或火焰干燥（远离火焰上方微加热干燥），然后通过火焰2~3次固定（玻片背面不烫手为宜）。根据不同要求进行染色等操作。过渡页菌悬液或液体培养物直接涂片法三1.制备菌悬液2.取菌3.涂布4.干燥、固定、染色等涂片法制片技术三、菌悬液或液体培养物直接涂片法1.制备菌悬液松棉塞→取无菌水→拿试管→拔棉塞→管口过火→加无菌水→拿取并灼烧接种环→刮取菌苔→管口过火→棉塞过火→塞棉塞→振荡

涂片法制片技术三、菌悬液或液体培养物直接涂片法2.取菌拿试管→松棉塞→管口过火→拿滴管→取菌→管口过火

塞棉塞←棉塞过火

涂片法制片技术三、菌悬液或液体培养物直接涂片法3.涂布左手拿起载玻片，将滴管里的菌悬液滴在载玻片中央，将滴管放在消毒液中。右手拿接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌，将菌悬液在载玻片上涂布均匀，灼烧接种环。涂片法制片技术三、菌悬液或液体培养物直接涂片法4.干燥、固定、染色等将涂片自然干燥或火焰干燥（远离火焰上方微加热干燥），然后通过火焰2~3次固定（玻片背面不烫手为宜）。根据不同要求进行染色等操作。制片原理及常用的方法制片原理一制片常用的方法二目录页制片原理及常用的方法一、制片原理微生物个体很小，要观察微生物的形态、大小必须把微生物制成标本片，然后才能在显微镜下观察，把微生物放到载玻片上制成微生物标本片的技术称为制片技术。过渡页制片常用的方法二1.涂片法2.水浸片法3.压片法4.插片法5.载片培养法6.透明薄膜培养法7.悬滴法制片原理及常用的方法二、制片常用的方法1.涂片法将少量待观察微生物直接涂布在载玻片上制成微生物标本片的方法称为涂片法。操作简单，容易掌握，适用于单细胞微生物、霉菌、放线菌孢子等的结构和形态观察，在干燥固定过程中，细胞常会因受热发生变形、收缩的情况，只能观察到微生物近似的形态和大小。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法2.水浸片法又称压滴法，是将欲观察微生物置于载玻片上的水滴或染色液中，然后盖上盖玻片而制成微生物标本片的一种制片方法。水浸片法操作简单，适用于单细胞微生物、霉菌、放线菌孢子等的结构和形态观察，可以观察到细胞真实形态。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法3.压片法也称压印法、印片法，是将待观察微生物压印在载玻片或盖玻片而制成微生物标本片的方法。可用于放线菌和霉菌的菌丝及其孢子形状、排列方式数目等观察。优点是能够清楚的观察到孢子的生长情况，缺点是不易观察到气生菌丝、繁殖菌丝和基内菌丝等的完整生长情况。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法3.压片法用接种铲挖取斜面或平皿培养物（带一小块培养基），将盖玻片盖在有菌苔的培养基小块上，用镊子轻压几下，使小块培养基上的部分菌丝体压印在载玻片上，不要移动。然后固定载玻片上的印痕，并对其进行染色观察。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法4.插片法插片法是将盖玻片斜插入培养基，将菌种接种到盖玻片与培养基交界处，培养后将长有菌体的盖玻片置于显微镜下直接染色后观察的制片技术。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法4.插片法将制备好的培养基倒入培养皿中，待凝固后取无菌盖玻片以45°角斜插入培养基，深度以培养基厚度1/2为宜，然后将待观察的材料接种于盖玻片和培养基的交界处，置于恒温箱中培养，观察时用镊子拔出盖玻片，擦净背面后镜检观察，也可放在滴有染色液的载玻片上观察。插片法主要用于霉菌或放线菌的菌落或菌丝形态观察，可观察到菌丝的自然着生状态。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法5.载片培养法

载片培养法是将要观察的微生物直接放在载玻片上进行培养而制成微生物标本片的技术。载片培养法主要用于观察霉菌、放线菌不同生长时期的菌体各部分形态，也可用于假丝酵母的培养观察。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法5.载片培养法用无菌操作将营养琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌或放线菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。制片原理及常用的方法二、制片常用的方法6.透明薄膜培养法透明薄膜培养法是将待观察微生物培养在透明薄膜上，然后将透明薄膜连同微生物一起转移到载玻片上而制得微生物标本片的一种制片技术。该法常用于观察