基因工程(全英)

全国高等医药教材建设研究会卫生部规划教材全国高等学校教材供七、八年制临床医学等专业用医学分子生物学MedicalMolecularBiology主编冯作化人民卫生出版社2005年8月第一版课件制作：吴耀生(版权所有)广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室2009.12第十三章基因工程与基因体外表达GeneEngineeringandGeneExpression目的与意义1.获得感兴趣的目的基因2.研究基因结构特征3.表达基因产物4.研究基因功能基本要素1.目的基因(targetgenes)2.工具酶(toolenzymes)3.载体(vectors)4.宿主细胞(hostcells)Maincontents

工具酶DNA载体基因克隆过程真核细胞基因转染基因改造克隆基因表达电子克隆基本概念及背景ForExample

如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)?1.查资料认识FPS2.设计实验方案3.可行性分析ForExample

FPS克隆：RT-PCR，3'-RACE，5'-RACE改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNART-PCR扩增fps部分保守序列3’-RACE及克隆测序5’-RACE及克隆测序序列拼接mRNA:5’AAAAAA3’TTTTTTT-接头cDNA:OligodT接头基因特异性引物3’FullRACE原理图5’FullRACE原理图(1)P5’-端磷酸化RT-Primer未知区域已知序列TargetmRNAAAAAAAAA-----5’AAAAAAAA-----5’P未知区域逆转录RNA分解P未知区域未知区域S1A1S2A21stPCRprimers2ndPCRprimers用RNAligase进行环化或形成首尾连接物未知区域1stand2ndPCR5’-端磷酸化RTprimer部位包含未知的5‘上游区域的扩增产物(2)(3)(4)ThankYouDNA重组DNArecombinationSomeconcernedconcepts:DNA重组技术DNArecombinationtechnique分子克隆Molecularcloning基因工程Geneticengineering克隆Cloning三大理论基础1953年，Watson和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自我复制和传递的过程。40年代，O.T.Avery等通过肺炎链球菌转化实验发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质50年代末到60年代初，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流向和表达问题。三大技术发明

DNA分子的体外切割与连接技术

1970年Smith,Wilcox流感嗜血杆菌(Haemopbilusinfluenzae)HindII1972年BoyerEcoRI“GAATTC”1967年世界上5个实验室几乎同时发现了DNAligase1970年T4DNAligase大肠杆菌转化体系的建立----复制工厂基因工程载体的使用：plasmid,phage,viruses1978年Nobel医学与生理学奖TheNobelPrizeinMedicinewasawarded,in1978,toDanielNathans,WernerArber,andHamiltonSmithforthediscoveryofrestrictionendonucleases.TheirdiscoveryleadtothedevelopmentofrecombinantDNAtechnologythatallowed,forexample,thelargescaleproductionofhumaninsulinfordiabeticsusingE.colibacteria.Over3000restrictionenzymeshavebeenstudiedindetail,andmorethan600oftheseareavailablecommerciallyandareroutinelyusedforDNAmodificationandmanipulationinlaboratories.DNAligaserepairingchromosomaldamage.ligaseI,DNA,ATP-dependent第一节基因克隆是利用工具酶进行操作工具酶(Toolenzymes)----用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进行应用一、限制酶(RE,restrictionendonuclease)二、其他工具酶(othertoolenzymes)一、RE在基因克隆中用于切割DNARE(restrictionenzyme,restrictionendonuclease)----限制性核酸内切酶，限制酶，能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键，产生特定末端的酶RestrictionenzymeFunctions:能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键(1)Sortingofrestrictionenzyme有三型，但最重要的是II型酶(2)NamingofRE细菌属名细菌种名细菌菌株编号EscherichiacoliRY13I属—Genus,

种--species,

菌株--strainEcoRITwocatalyticmanganeseions(onefromeachmonomer)areshownasmagentaspheresandareadjacenttothecleavedsitesintheDNAmadebytheenzyme(depictedasgapsintheDNAbackbone).StructureofthehomodimericrestrictionenzymeEcoRI(cyanandgreencartoondiagram)boundtodoublestrandedDNA(browntubes)basedonthePDB1QPSX-raycrystallographiccoordinates.(3)限制酶的识别和切割位点Characters:通常识别4~6个碱基，少数识别8个所识别的序列一般为回文结构(palindrome)在特异位点内切割DNA双链，产生两种末端粘性末端平端5’-粘性末端3’-粘性末端5’-CCCGGG…-3’3’-GGGCCC…5’5’-CCC

GGG…-3’3’-GGG

CCC…-5’+平端切割(bluntend,suchasSmaI)Goto1095’-GGTGAATTCAGC…-3’3’-CCACTTAAGTCG…5’5’-TTGCTGCAGAAG…-3’3’-AACGACGTCTTC…5’5’-粘性末端(EcoRI)3’-粘性末端(PstI)5’-GGTG

AATTCAGC…-3’3’-CCACTTAAGTCG…5’+5’-TTGCTGCAGAAG…-3’3’-AACGACGTCTTC…5’+(4)同工异源酶(isoschizomers)

来源不同，但能识别和切割同一位点的RE例：BamHI&BstI(G↓GATCC)XhoI&PaeR7(C↓TCGAG)(5)同尾酶(isoaudamers)

识别序列不同，但产生相同粘性末端的RE例：BamHI(G↓GATCC)Sau3AI(N↓GATCN)RE作用的条件：

一定的盐溶度；Mg2+;不需ATPRE识别序列长度与切点数：对同一DNA，识别序列短的，切点数多，片段较短；反之则反之二、基因克隆需要具有不同功能的工具酶其他工具酶----用于对DNA分子进行多种操作，也叫修饰酶作用：剪切、补平、连接、化学修饰等常用：(1)DNApolymeraseI，KlenowFragment(2)Reversetranscriptase(3)T4DNAligase(4)Alkalinephosphatase(5)Terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT(6)TaqDNApolymeraseSoon(1)DNApolymeraseIActivities：5’→3’聚合活性，5’→3’及3’→5’外切活性Functions：在生物体内，填补引物切除后留下的空缺，修复在生物体外，缺口平移制备探针DNApolymeraseIKlenowfragment(76KD)Anothersmallfragment枯草杆菌蛋白酶Klenow片段35kD76kDNCE.coliDNApolI5’→3’外切酶5’→3’聚合酶3’→5’外切酶用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶5’→3’聚合酶3’→5’外切酶76kDCKlenowfragment用途：1)补齐双链DNA的3’-末端2)通过补齐3’端使3’端标记3)在cDNA克隆中，第二股链的合成4)DNA序列分析常用的reversetranscriptase:禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶(2)Reversetranscriptase用途：合成cDNA，构建cDNA文库Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶第二节基因克隆需要特定的DNA载体基因克隆为什么需要载体？载体的类型----克隆载体，表达载体载体的来源细菌质粒噬菌体DNA(λDNA,M13DNA)病毒DNA人工载体(cosmid)等DNA载体(vector)----能与DNA片段连接，构建成新的重组DNA分子，并可携带该外源DNA片段进入一定宿主细胞，在宿主中扩增甚至表达，并有遗传标记进行筛选载体的概念Cloningvector——能够携带感兴趣的外源DNA（targetDNA）进入宿主细胞，并将外源DNA在宿主内进行克隆和扩增，而采用的一些DNA分子称为Cloningvector。CloningvectorclassesPlasmidDNA(质粒DNA)PhageDNA(噬菌体DNA)VirusDNA(病毒DNA)Expressionvector————能使外源基因在宿主中表达的载体Expressionvector:含表达调控有关的元件WhenEcoliisusedashostcell,plasmid,λphage,cosmid,M13phagecanusuallybeusedasvectors载体的本质是什么？

Vectorcharacters(cloningvector):能在宿主细胞中自我复制、自我表达分子相对较小，在宿主细胞中有高拷贝具有遗传标志有多个限制性酶单一酶切位点(多克隆位点)易与宿主DNA相分离一、常用克隆载体主要来自质粒和病毒(一)质粒是常用的克隆载体Examples:pBR322pUCCharacters:Smallmolecularweight,highcopiesMorethanonegeneticmarkMultiplecloningsites,MCSpBR322Turnto64pUC19(二)噬菌体经过重组也可以携带外源DNAExamples:λbacteriophage,phage;M13phageItisakindofviruswhichcaninfectbacteriaλbacteriophagesincommonuse:EMBLspectrumλgtspectrumCharonspectrumλbacteriophage,phage

λ噬菌体是侵犯细菌的病毒。在菌体内为环状DNA分子；分离产物为双链线状DNA分子，有天然的粘性末端（称COS位点），进入宿主菌后可自行环合。基因组DNA长约为48.5Kb,共有66个基因，较复杂。Character：1、其生长必需的序列位于左右二臂上，中部约30%为生长非必需；2、成熟需要包装（大小为原来的75-105%时）Twokindsofvectors：置换型载体；插入型载体置换型λ噬菌体载体：用限制酶切除中央片段供目的基因替代，目的基因与左、右载体两臂结合。替代片段可达9~23Kb。左臂中央片段右臂酶切点酶切点切除后用目的基因取代COS位点COS位点（12bp)Thelifeperiodofλphage(噬菌体的生活周期):Lysogenicpathway(溶原生长途径)Lysispathway(溶菌生长途径)溶原生长溶菌生长溶原转溶菌生长以噬菌体为媒介的转导作用λgt10:insertionvector;multiplecloningsite:CIThepositivemarksofscreening:Whethertherecombinantvectorcanbewrapped(IfnoextraneousDNAreplaced,thevectorwouldbetoosmalltobewrapped)Withinsertion,CIactivitylost,tobetransparentspots;Withoutinsertion,CIkeepsintact,tobeturbidspotsλgt11：insertionvector;MCS:lacZ；expressedWithinsertionintolaczofλgt11,whitespotsOtherwisebluespots(四)粘性质粒适合克隆较大的DNA片段粘性质粒(cosmid)由λDNA的cos区与质粒重新构建的载体，具有与质粒相同的结构特点，为双链环状DNA。ItisconstructedwiththecosregionofλDNAandplasmid,whichisdoublecycleDNAwithbiggercontentforcloning(40~50kb)Characters:1)Withantibioticsmarksandreplicationelementitself2)Withcosregionofλphage,canbewrapped3)Withoneormorecloningsites4)Smallmolecularweight5)non-recombinationcosmidtoosmalltobewrapped,soitisscreenedeasily(三)M13噬菌体适合制备单链DNAM13bacteriophage:ItisakindofEcoliphage,thegenome6.5kb,acycleDNAcontainingsinglestrandDNATwoforms:Wildform;Replicationform(RF)Themostmerit:CanbereleasedfromhostassinglestrandM13phageCharacters:Invivo,doublestrandsDNA(canbereplicated)Invitro,singlestrandDNA(canbeusedastemplateforDNAsequencing,ormakeDNAprobesforhybridization)Afterenteringhostcells,itisreplicatedtodoublestrandsDNAandbecomesreplicationalformDNA(RFDNA)whichcanbeusedascloningvector(五)病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞Virusvectorsincommonuse:逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，EB病毒等病毒载体，可将外源基因导入受体细胞Characters:多数均已质粒化，由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记及pBR322复制起始点组成Othervectors:YAC,yeastartificialchromosome(0.5~2Mb)BAC,bacterialartificialchromosome(~0.4Mb)二、表达载体将外源基因带入宿主并表达ExpressionvectorsConcept:Theconditionsforexpressionvector:WithexpressionstructuresexceptforthecharactersofcloningvectorsThevectorswhichcanmaketheextraneousDNAbeexpressedinhostcellsaretermedasexpressionvectors.Sorts:ExpressionvectorsofEcoli(prokaryote)ExpressionvectorsofeukaryoteExpressionvectorsofmammalanimals(一)原核表达载体适于原核细胞表达外源基因ExpressionvectorsofEcoli:除克隆所需成分外，还含有启动子，核糖体结合位点，转录终止序列等表达元件Trp-lacpromoter(ortacpromoter)Inducer:IPTGStrains:RB791,XL-1-blue,SB221,JM1091.PromoterT7ofT7phage

ItisahigheffectiveexpressionpromoterStrain:JM109(DE3)PLofλ-phage(temperatureinducepromoter)ControlledbycIts857(sensitivetotemperature),clts857为温度敏感阻抑物Strain:M5219原核生物mRNA与核蛋白体小亚基结合的分子机制AUUCCUCCACUAGG核蛋白体小亚基的16S-rRNA5’AGGAPuPuUUUPuPuAUG3’mRNARps辨认序列SD序列Ribosome-bindingsite,RBS

IncludingAUG,SDsequence

2.核糖体结合位点(RBS)作用：

3.转录终止序列保证外源基因在宿主中的高效表达使读码框架能够正确转录(二)真核表达载体适于真核细胞表达外源基因Eukaryoteexpressionvectors:含有一定的原核序列：Ecoli中的ori位点；antibacterialsite含有一定的真核序列：真核细胞中的药物抗性基因；真核表达组件，如真核复制起点，启动子/增强子，克隆位点，加尾信号等

ExpressionvectorsofmammalanimalIfageneneedstobeexpressedinmammalanimalcells,theeukaryoteexpressionvectormustbeused.Theessentialelementsincluding:Replicaorigin,antibioticssites,eukaryotepromoter,enhancer,cloningsites,terminationsignal,polyAsignal第三节基因克隆过程包括五个基本部分Genecloningprocess(1)制备目的基因及相关载体(2)将目的基因与载体进行连接(3)将重组DNA导入受体细胞(4)DNA重组体的筛选与鉴定(5)DNA重组体扩增、表达及其他研究分切接筛转一、采用不同方法获取目的基因Methodstogetatargetgene:(1)Topreparegenomiclibrary(2)TopreparecDNAlibraryorcDNA(3)ToPCR(4)TosynthesizetheDNAfragmentbychemicalmethod(一)从基因组文库中获得目的基因Genomiclibrary:指含有一个机体基因组DNA的全套重组DNA分子的克隆群体用于构建基因组文库的载体：λ-噬菌体(λ-phage)，粘性质粒(cosmid)Genomiclibraryconstruction:分离高分子量DNA分离回收15~25kb的DNA片段部分消化，以切成一定大小片段回收片段与适当载体连接所有重组DNA分子转入宿主细胞并扩增基因组文库随机文库克隆数目计算随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库，有：ln(1-P)N=ln(1-)xyN:

克隆数目P:

设定的概率值(如：0.99)x:

插入片段平均大小(15~20kb)y:

植物基因组大小(以kb计)▲如果插入片段平均大小为20kb，某植物基因组大小为4x108bp，P=0.99时，根据上式，N≈1X105。含1X105个克隆的基因文库相当覆盖了5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。植物基因组大小及克隆文库所需噬菌斑数植物种类基因组大小(bp)a重组噬菌斑数b拟南芥7.7X1072.1X104大豆8.7X1082.4X105菜豆1.8X1094.9X105碧东茄1.9X1095.1X105烟草3.8X1091.0X106玉米3.9X1091.1X106小麦1.5X10104.1X106a，基因组大小引自Rogers和Bendich;b.假设插入片段为17kb,概率为0.99。(二)从cDNA文库中获得目的基因cDNAlibrary:指含有一个机体某种特定细胞或特定状态下表达基因的全部cDNA克隆的群体cDNAlibrarycharacters:不含内含子，用mRNA经逆转录构建cDNAlibraryvectors:λ-gt10;λ-gt11;λZiploxetalcDNAlibraryconstruction:分离mRNARNaseH水解去掉mRNA以oligo(dT)为引物，合成cDNA第一链随机引物，DNApolI合成第二链修齐两端，加人工接头，与载体连接，得到cDNA重组体，所有cDNA重组体均转入宿主扩增cDNA文库(三)利用PCR技术获得目的基因采用T载体(AT克隆)：pGEM-Tvector;pMD18-TVector

合成长度有限可人工设计相应的序列，不必使用天然模板(四)人工合成目的基因PlasmidλphagecosmidM13phageCapacity<10kb<22kb40~50kb<1kbofcloninggDNAlibrary-++-cDNAlibrary++--Subcloning+--+Sequencing++-+Ecoliexpression++--二、依据基因克隆的目的选择和准备载体Cloningvectorsincommonuse:(1)TheligationbycohesiveendsAdvantage:easilylinkedDisadvantage:easilytobecycledselfbidirectioninsertion(2)Theligationwithartificiallinker(3)Theligationwithhomopolymerictail

(4)TheligationbybluntendsHighATPcon.T4DNAligaseshouldbeused三、选择适当的策略将DNA片段进行连接Methodsincommonuse:(一)粘性末端的连接全同源粘性末端最方便，但载体自身环化，并为双向插入5’————G3’————CTTAAppAATTC————3’G————5’————G————CTTAAppAATTC————G————5’————G3’————CTTAAppAATTC————3’G————5’例：用EcoRI分别切割载体和目的DNA：切割载体：切割目的DNA：————G————CTTAAAATTC—————G————AATTC————3’G————5’5’————G3’————CTTAA双向插入示意图：————G————CTTAAAATTC—————G————AATTC————3’G————5’5’————G3’————CTTAA粘性末端的连接(二)用人工接头法克隆cDNA连接酶碱性磷酸酶(三)同聚物接尾法克隆双链DNA转化适当的宿主退火载体(一)转化(transformation)四、重组DNA需要导入宿主细胞进行扩增Methodsincommonuse:(二)感染(infection)(三)转染(transfection)(四)电穿孔(electroporation)(一)转化是直接将DNA导入细菌的方法Transformation：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。

宿主菌：Ecoli感受态细胞的制备：低温CaCl2处理，使细胞通透性增加，易于摄取外源DNA，这种细胞称为感受态细胞(competentcell)(二)感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主Infection：指λ噬菌体、粘性质粒或真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后感染适当宿主细胞的过程

用于包装的宿主菌：λ琥珀突变株Dam溶菌物：含头部蛋白λ突变株Eam溶菌物：含尾部蛋白Dam溶菌物+Eam溶菌物+λDNA重组体包装噬菌体重组有外源DNA的逆转录病毒载体感染辅助病毒φ-2细胞包装成病毒颗粒有感染能力(三)转染是将外源DNA导入真核细胞的方法Transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程Methods：电穿孔磷酸钙共沉淀法脂质体融合法进入细胞的DNA存在方式染色体外整合至宿主基因组中(一)遗传学方法五、重组DNA导入宿主后筛选与鉴定Methodsincommonuse:(二)免疫学方法----检测表达产物(三)核酸杂交(四)PCR技术抗性标记表型标记插入失活α互补(五)酶切鉴定Goto23Goto103Goto104Goto105第四节真核细胞基因转染Transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程一、真核细胞转染的方法与基本原理二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选(一)磷酸钙共沉淀示介导基因转染一、真核细胞转染的方法与基本原理Methodsincommonuse:(二)电穿孔法介导基因转染(electroporation)(三)DEAE-葡聚糖法介导基因转染(DEAE-dextran)(四)脂质体介导基因转染(liposome)(五)显微注射法(microinjection)Calciumphosphateco-precipitation(1%)Electroporation(电穿孔法)ExtraneousDNAHostcellsElectricitywithhighfrequency(一)利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选二、转染细胞可利用抗性标记进行筛选Methodsincommonuse:(二)药物筛选转染细胞稳定转染细胞株的筛选(一)利用TK-细胞突变株进行转染细胞筛选Principle：TK(thymidinekinase)是催化核苷酸补救合成的关键酶氨基喋呤(aminopterin,A)是从头合成途径的抑制剂，A的加入使细胞主要依赖于补救合成TK-选择系统Host----TK-细胞株(TK表达缺陷)培养基----HAT培养基H,hypoxanthine;A,aminopterin;T,thymineTk-氨基蝶呤（A）处理抑制二氢叶酸还原酶四氢叶酸逐渐耗尽dUMPdATPdCTP(-)(+)HdATPdCTPTdTTPTk+培养基含H、TA细胞不能存活细胞能够存活补救合成tk基因导入tk-细胞细胞能够存活在含HAT培养基中tk选择系统原理图解(越过A的抑制)Thescreeningwithantibiotics,G418(geneticin,新霉素衍生物)(二)药物筛选转染细胞Themostusedantibioticmarker:neor新霉素抗性选择系统新霉素干扰原核生物蛋白合成不影响真核生物蛋白合成新霉素类似物G418干扰原核生物蛋白合成干扰真核生物蛋白合成细菌新霉素抗性基因neor表达氨基糖苷磷酸转移酶(APH)使G418失活表达neor

的细胞可在含G418的培养基中存活第五节利用重组DNA技术进行基因改造Methodsincommonuse:定点诱变技术寡核苷酸介导定点诱变技术PCR介导定点诱变技术目的改变基因的一级序列特征一、对特定基因可进行定点诱变Whatisthesite-directedmutagenesis(目的基因的定点诱变)?Itmeanstheprocessthattheoneormoresitesofgenebereplacedordeletedbyartificialmethod.(一)带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变

Thesite-directedmutagenesismediatedbyoligonucleotideCharacters:ItcancausefinelythemutagenesisatthespecialsiteaccordingtothedesignofresearchersProcesses:1)TheuseofKlenowfragmentandaprimerwithanincorrectpairedbase,M13assinglestrandtemplate2)ToextendtheprimertogetaheterozygousdoublestrandsDNA3)TotransformtheheterozygousDNAintoEcoli,thewildDNAandmutatedDNAwillbeyielded4)ToscreenanddecidethemutatedDNA，furtherresearchthemutatedDNA诱变寡核苷酸引物单链M13模板Klenowfragment,dNTP,T4DNApol杂交双链DNA转化Ecoli琼脂平皿标记诱变寡核苷酸原位分子杂交放射自显影寡核苷酸介导的定点诱变基本实验步骤理论上最高诱变效率只有50%(二)含U模板可以提高寡核苷介导定点诱变效率Principle:建立含U单链模板(U取代T)----正链合成杂合双链DNA杂合双链DNA转化野生型Ecoli中尿嘧啶核苷酶降解含U的正链带诱变位点的负链能保存，合成双链DNA(突变体突变率90%)诱变寡核苷酸引物Klenowfragment,dNTP,T4DNApol转化野生型Ecoli，含尿嘧啶核苷酶，可降解含U模板标记诱变寡核苷酸原位分子杂交放射自显影U模板介导的定点诱变基本实验步骤含突变体的负链保存下来并进行复制扩增，筛选鉴定突变率90%单链M13模板UUUUUUU杂交双链DNAUUUUUUU(三)