基因工程原理与技术-3

第三章基因工程载体

载体(vector)是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA复制子。

必备基本条件：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；②具有合适的限制性内切酶位点；③具有合适的选择标记基因。根据来源和性质不同载体可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。根据功能和用途不同载体可分为克隆载体、表达载体(标签载体、分泌载体)、测序载体、转化载体、多功能载体等。根据受体细胞不同载体分为原核生物载体(大肠杆菌载体)、真核生物载体(酵母载体、植物载体、动物载体)。

第一节质粒载体质粒载体大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，共同具有复制必需区、选择标记基因、限制性酶切位点(克隆位点)。一、质粒的一般生物学特性质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子，大小为1~200kb以上。存在于细菌(最广泛)、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。

1、质粒的分子特性

双链环形DNA(绝大多数)、双链线形DNA、RNA(酵母的杀伤质粒)。提取的质粒有三种构型：①闭合环形DNA(超螺旋构型)，②开环形DNA，③线形DNA。

2、质粒的复制类型严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝

质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与R1质粒正好相反。

大多数质粒载体的复制起始区都来源于pMB1质粒，正常情况下在宿主细胞中可维持至少15个拷贝。氯霉素、或链霉素等存在可使质粒的拷贝数达到几千个。

3、质粒的不亲和性

质粒的不亲和性(不相容性)是指在没有选择压力的情况下，两种质粒不能够在同一个宿主细胞中稳定地共存的现象。见下图彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(ColE1/pMB1)，而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同的不亲和群(p15A/ColE1或pMB1)。4、质粒的转移性

质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

质粒接合型质粒(自我转移质粒):多属于严紧型

非接合型质粒(不能自我转移质粒):多属于松弛型

质粒的迁移作用是指非接合型质粒在接合型质粒共存时可发生转移的现象。如ColE1(必须具备nic位点、mob基因)

二、理想质粒载体必须具备的条件1、天然质粒用作载体的局限性分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适。天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记pSC1015.8×106（9.09kb）1~3EcoRItetrColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr9.09kb2、理想质粒载体的必备条件①具有较小的分子量和较高的拷贝数；②具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点，multiplecloningsites，MCS)；

多克隆位点(多接头，polylinker，或限制性酶切位点库）是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。

③具有两种以上的选择标记基因；

④缺失mob基因或nic位点；

⑤插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。

三、质粒载体的构建1、载体构建的基本原则①根据基因操作的工作需要；②符合理想载体的必备条件；③选择适合的亲本质粒提供载体元件；④尽量简化构建程序。2、pBR322的构建

3个亲本质粒(见图)1、Tn3转座到pMB1上形成pMB3；2、pMB3的EcoRI*片段重排形成了更小的pMB8；3、pSC101的EcoRI*片段与pMB8的EcoRI*片段连接形成pMB9；4、Tn3转座到pMB9上形成pBR312；5、pBR312的EcoRI*片段重排形成pBR313；6、pBR313的EcoRII片段重排形成pBR320；7、pBR313的PstI片段重排形成pBR318；8、pBR320的PstI和HincII双酶切片段与pBR318的PstI和HapI双酶连接形成pBR322。4R1drd19(Tn3)pMB1pMB3pMB8pSC101pMB9pBR312pBR313pBR32011233456pSF2124(Tn3)pBR3187pBR32283、pBR322的改良①进一步降低载体的大小；如pAT153、pXf3等。优点：

a、失去了pBR322的HaeII的两个片段，分子量更小，拷贝数高pBR322的1.5~3倍；b、失去了nic位点，更安全。pAT153②引入带单一EcoRI的选择标记；如pBR324(9.1kb，具有大肠杆菌素E1基因和免疫imm基因)、pBR325(氯霉素抗性基因)。③引入lacZ’选择标记基因；如pUC系列载体(见下图)

④引入MCS位点；如pUC系列载体(见下图)。lacZ’基因：大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子和β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸(α-肽)的编码序列。α-互补：是指载体表达的α-肽与宿主菌中F′因子的lacZ’△M15基因的突变产物结合(α-肽与突变β-半乳糖苷酶的C-端片段结合)形成具有酶活性的功能蛋白质的现象。蓝白斑筛选(α-筛选

)：是指利用外源基因插入载体上lacZ’5’端的多克隆位点而破坏α-互补、不能催化平板培养基中5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)形成蓝色产物、致使形成白色的重组菌落而筛选出重组子的方法。

四、常用的质粒载体类型1、克隆质粒载体克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。如：pBR322及其派生质粒载体、pUC系列载体、T载体。

pUC质粒载体较pBR322有四个优点T载体HphI的识别序列T/A克隆2、表达质粒载体

表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。

表达载体(根据受体细胞)原核细胞表达载体真核细胞表达载体表达载体(根据表达蛋白的转运)分泌型表达载体非分泌型表达载体表达载体(根据表达蛋白的组成)融合型表达载体非融合型表达载体pBV221rrnB大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列；③强终止子。如rrnB。制备RNA探针的载体两条链RNA探针的制备程序简化外源蛋白纯化的载体(标签载体)pBAD/His常用的标签：多聚组氨酸残基、结合麦芽糖蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶。

亲和层析法纯化外源蛋白。BglIIsiteoftheMCS.pBAD/His的三种变体(3种读码框)Myc：myc抗体的抗原决定簇标签为生物素羧化酶载体蛋白基因链霉素亲和层析柱3、多功能质粒载体具有克隆、表达、测序、体外转录等多种功能，避免了重复操作。如pGEM系列质粒载体：

4、穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)

穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体。

第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体载体的生物学特性

1、λ噬菌体的生活周期

2、λ噬菌体的基因组结构和功能

cos位点(cohesive-endsite)：λDNA环化时其粘性末端形成的双链区段.左侧区：A~J，约20kb

右侧区：N~R，约12kb中间区：J~N，约18kb，为非必须区段cI基因控制溶源过程，阻遏溶菌周期所有基因的表达3、λ噬菌体的DNA复制

裂解周期的早期：θ型双向复制，产生环状DNA分子；

裂解周期的晚期：σ型滚环复制，产生线性多聚体DNA分子。

5’二、λ噬菌体载体的构建1、构建λ噬菌体载体的基本原理

野生型λ噬菌体不适于用作载体：①λDNA基因组大，具有常用限制性核酸内切酶的识别位点多个(如5个BamHI位点、6个BglII位点、5个EcoRI位点、7个HindIII位点等)；②λ噬菌体具有包装限制，外壳只能接纳一定长度(即相当于λ基因组大小的75％~105％)的DNA分子，只能克隆2.5kb的外源DNA片段。

对野生型λ噬菌体的改造：①切除掉λDNA的非必需区段；②除去λDNA必需区段中的限制酶识别位点，在非必需区引入合适的限性酶位点；

③引入适当的选择性标记；④在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体。

2、构建λ噬菌体载体的基本内容①除去多余的限制酶识别位点利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技术。例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。根据克隆位点数，可将λ噬菌体载体分为插入型载体(insertionvectors)和取代型载体(replacementvectors，置换型载体)。

插入型载体：只具有一个克隆位点可供外源DNA插入的λ噬菌体载体。克隆容量较小，一般在10kb以内，用于cDNA及小片段DNA的克隆。

根据噬菌斑的混浊和清亮来区分重组体取代型载体：具有成对的克隆位点以使两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段取代的λ噬菌体载体。克隆容量较大，20kb左右，常用来构建高等真核生物的基因组文库。

②切除掉λDNA的非必需区段按野生型λDNA分子长度为48kb计算，λ噬菌体的包装上限是51kb，而必需DNA区段约28kb，因此，λ载体克隆外源DNA的理论极限值是23kb。包装限制是对重组体的一种正选择(见下图)。③引入适当的选择标记

在λ噬菌体载体的非必需区段插入LacZ'基因，其中带有多克隆位点。④引入无义突变在裂解周期的必需基因内引入无义突变，λ噬菌体便只能在具有无义突变抑制基因的大肠杆菌宿主中存活。如Charon4A是在晚期基因A、B中引入了琥珀突变。

BamHI三、常用的λ噬菌体载体

1、LacZ’基因失活的插入型载体如：λgt11、λgt18~23、Charon2、Charon16A等。2、免疫功能(cI基因)失活的插入型载体如：λgt10、λNM1149及Charon6、Charon7等。3、Charon系列取代型载体如：Charon32~35、Charon40、Charon21A等。其MCS含有EcoRI、SacI、SmaI、XbaI、SalI、PstI、HindIII、BamHI

4、λEMBL系列取代型载体如：λEMBL3、λEMBL4、λEMBL3A等。

5、Spi-选择取代型载体

野生型λ噬菌体不能在在P2噬菌体的溶源菌中生长，即为Spi+表型。当其缺失red、gam基因，就能在P2溶源菌中能生长并形成噬菌斑，便获得Spi-表型。这类载体的中间填充片段上都具有red、gam基因，当中间填充片段被外源DNA取代后，重组体便能在P2溶源菌中生长并形成噬菌斑，而非重组体则不能在P2溶源菌中生长，这种筛选重组体的方法称为Spi-选择。6、λZAP插入型载体

在λZAP中，含有一个pBluescript噬菌粒的DNA片段(见下图)，位于J基因和cI基因之间，两侧是f1复制起始子和终止子，在辅助噬菌体M13或f1存在下，能获得带外源DNA的噬菌粒，用于测序和限制图谱构建等(其它λ载体的缺陷)。

第三节单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd是一类丝状大肠杆菌噬菌体，都含有同源性很高的6.4kb单链环状的DNA分子。目前，以M13噬菌体构建出一系列单链DNA噬菌体载体。

优点：①它们不存在包装限制问题，能包装6倍基因组长的DNA分子，克隆容量大。②制备单链DNA分子，用于基因定点突变、基因测序、杂交探针制备等。③容易地测定出外源DNA片段的插入方向。④可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA，如同质粒一样，能在体外进行基因克隆操作。⑤其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。一、M13噬菌体的一般生物学特性

1、M13噬菌体的基因组结构

基因VIII和基因III、基因II和基因IV之间的间隔区较长，其他基因间隔区只有数个核苷酸。虽然基因II和基因IV之间的间隔区(507nt)包含有复制和转录的调控序列，但外源DNA在此插入，并不影响噬菌体DNA的复制。

2、M13噬菌体感染、复制及包装

M13噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生溶菌，但会减慢其生长。基因II基因Ⅴ二、M13噬菌体载体的构建M13mp1是构建的第一个M13噬菌体载体，是在M13噬菌体的IG区段的BsuI限制酶切位点上插入了大肠杆菌的lacZ’序列，但仅具有基因工程中不常用的AvaII、BglII、PvuI的单一酶切位点及PvuII三个酶切位点。M13mp2

是利用点突变把M13mp1的

-肽的第5个氨基酸密码子中的鸟嘌呤转换成腺嘌呤，从而引入了一个EcoRI限制酶切位点。M13mp3

同样是在M13mp1的

-肽的第119密码子位置引入一个EcoRI限制酶切位点。M13mp7~11、M13mp18和M13mp19等是在M13mp2的EcoRI位点引入人工合成的多克隆位点。

M13mp7的MCS呈对称排列,而其他的呈非对称排列,这样用两种酶消化会产生两种末端的DNA片段.三、M13噬菌体载体的主要用途①DNA测序；②基因定点突变；③探针制备。四、M13噬菌体载体的缺点①插入的外源DNA片段不稳定，片段越大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅1.5kb。②理论上M13噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的取向插入的。

五、噬菌粒载体

噬菌粒载体是一类含有单链噬菌体(M13)复制起点的质粒载体。

噬菌粒载体的优点：①分子量较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段。②在宿主细胞内可按质粒DNA复制，形成的双链DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，按M13噬菌体的滚环复制模型进行复制产生单链DNA分子。③具有多种功能。如基因克隆、基因定点突变、DNA测序、体外转录等

在多克隆位点的两侧具有T7噬菌体启动子，可进行体外转录。

第四节黏粒载体(cosmidvector

)黏粒载体是一类含有λ噬菌体cos序列的质粒载体。又称柯斯质粒载体。

一、黏粒载体的特点①具有λ噬菌体的体外包装、高效感染等特性。当然黏粒载体本身不能在体外被包装，只有在克隆了合适长度的外源DNA片段，才能被包装成噬菌体颗粒，这是对重组子的正选择。

②具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。

③黏粒载体的分子量较小，克隆容量大。按λ噬菌体包装限制(38~51kb)，黏粒载体的最大克隆容量为48kb(如pHS262)，最低为14kb(如pJC720)。

④具有与同源序列的质粒进行重组的能力。二、黏粒载体的构建黏粒载体都是在通用的克隆质粒载体的基础上，引入cos序列以及其它一些序列构建而成的。如pHC79来源于pBR322，pJB8来源于pAT153。

此外，①引入两个cos位点，如c2XB，解决黏粒克隆存在的问题；②在多克隆位点两侧引入一对T3、T7噬菌体启动子，制备RNA探针，用于鉴别黏粒文库中的重叠克隆。如pWE15、pWE16。

③构建与常用的大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的黏粒载体。如pcos1EMBL，与colE1之间缺乏同源性。④导入真核细胞病毒的复制起点及相关选择性标记，从而构建了大肠杆菌-真核细胞的穿梭载体。如pWE15、pWE16等。

三、黏粒克隆的基本程序、存在的问题及解决方案黏粒克隆是指应用黏粒载体克隆大片段DNA的技术。1、黏粒克隆的基本程序2、黏粒克隆存在的问题及解决方案①在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚体分子。解决方案：一是用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；二是使用Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案(见下图)；三是使用Bates-Swift黏粒克隆方案(双cos序列的黏粒载体，见下图)。②在连接反应中，酶切的基因组DNA片段(特别是较小的DNA片段)往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。因此，DNA序列分析结果往往会出现错误。

解决方案是将局部消化产物通过凝胶电泳分级分离，获得长度为31~45kbDNA片段。

Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案PartialSau3AdigestionPhosphatasePartialSau3Adigestion,phosphataseBamHISmaIBates-Swift黏粒克隆方案四、常用黏粒载体及应用

常用的黏粒载体：pJB8、c2XB、、pHC79、pWE15、pWE16、pcos1EMBL、Charomid系列等。

黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建。由于其克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳性克隆的检出率，大大地减少了工作量。

黏粒载体在以下两种情况下特别有优势：①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。第五节其它载体一、人工染色体1、酵母人工染色体(YAC)

①酵母自主复制序列；②酵母着丝粒；③四膜虫端粒；④酵母选择性标记(Trp1、Ura3、Sup4——抑制宿主细胞ade2的琥珀突变)。克隆容量：100~2000kb

SUP411.4kbYAC的优点：克隆容量大，构建的基因组文库克隆数少，能保持基因组特定序列的完整性，有利于制作物理图谱。

YAC的缺点：①用其克隆外源基因易出现嵌合体(40％~60％的克隆是嵌合体，由于重组所致)；②某些克隆不稳定，有从插入序列丢失其内部区段的倾向(由于重组所致)；但可以通过将YAC文库转化到重组缺失的宿主来减少嵌合体形成和不稳定性的问题；③YAC克隆不容易与酵母自身染色体(15Mb)相分离。2、细菌人工染色体(BAC)6.9kb来源于F质粒。克隆容量：300kb优点：拷贝数低，稳定，比YAC易分离。

3、P1派生人工染色体(PAC)P1噬菌体载体PAC载体F1Replicon克隆容量：100~30