台锥形制备液相色谱柱柱柱效的柱上可视化研究

台锥形制备液相色谱柱柱柱效的柱上可视化研究

近年来，随着制药工业和生物技术的发展，溶液铬的制备得到了广泛应用。在提取生物活性成分和植物中有效成分的过程中,由于样品成分复杂,并且有效成分的含量很低,需要多次循环操作才能制备出纯度较高的产品,导致生产成本的提高。制备色谱考虑的是如何用最低的生产成本制备出产品,即提高产率,所以提高柱效和柱的样品负荷容量是制备色谱柱的研究重点。制备柱的内径远大于分析柱的内径,装填技术比较复杂而且要求很高,更突出的问题是样品在柱头的分配很难达到均匀,因此造成表观柱效低于分析柱。如何改善色谱柱的装柱技术,以及如何使样品在色谱柱柱头实现更均匀的分配,一直是制备色谱工作者关注的问题。近几年有更多的学者关注制备色谱柱的研究。在制备液相色谱中,筛板用于承载填料,防止填料进入色谱柱输液管路中造成阻塞。此外,柱头筛板还具有避免床层被高速液流破坏和对样品进行一定程度分配的功能。制备液相色谱柱直径较大,因此柱头筛板对样品的分配及对柱效的影响很大,筛板的厚度、相对直径和孔径均对色谱柱的柱效有显著的影响。由于筛板的影响能使色谱柱柱效相差10倍,美国橡树岭国家实验室的Guiochon等用可视化研究方法考察了圆柱形制备液相色谱柱中柱头筛板的直径和孔径对流型的影响。考察柱效高低的最直接方法是观察样品在色谱柱内的谱带流型和运动状态。在液相色谱中获得塞子状的流型是人们追求的目标,因为这意味着高柱效。研究谱带流型,对于研究制备柱的柱头和样品分配筛板设计、装柱技术、柱型选择和设计、填料和流速选择、进样方式等具有重要的指导意义。我们根据可视化方法的原理,研究了制备级台锥形液相色谱柱的谱带流型,结果表明台锥形制备柱比相同体积、相同长度的圆柱形制备柱有更高的分离柱效和更大的样品容量。实验过程中我们发现,柱头筛板材料及直径的选取对台锥形柱内样品的流型有很大影响。本文比较了使用多孔聚四氟乙烯(PTFE)筛板和多孔烧结不锈钢筛板时样品谱带的流型和柱效,考察了柱头筛板的相对直径对台锥形柱内样品谱带流型的影响。1实验部分1.1紫外-可见变波长检测环己烷(分析纯,辽宁省医药经贸公司试剂厂)作为液相色谱流动相;碘(分析纯,天津市励特吉尔环保技术研究所)作为观察流型用的有色试剂,用环己烷配制成碘质量浓度为10g/L的有色溶液,经固相萃取柱过滤后使用(固相萃取柱内使用与色谱柱相同的填料);丙三醇(分析纯,沈阳市联邦试剂厂)作为折射率补偿溶剂。LC-100P高流量HPLC泵(大连江申分离科学技术公司);LC-830紫外-可见可变波长检测器,波长范围190~600nm(SomaOptics,Ltd.,Japan);科分Win-98色谱工作站,Ver.1.08(中国科学院大连化学物理研究所);DSC-S85Cyber-shot数码照相机(SonyCorporation,Tokyo,Japan)。1.2充填材料本构模型自制台锥形色谱柱尺寸50mm(柱长度)×20mm(入口内径)→7mm(出口内径),柱管材均采用有机玻璃,柱管内壁镜面抛光。柱内填充40~63μm无定型C-GelC18化学键合硅胶(CUChemieUetikonAG,Switzerland),干法填充。筛板板厚均为2mm、孔径均为20μm,制作材料分别为多孔烧结不锈钢材料(北京安泰科技股份有限公司)和多孔聚四氟乙烯材料(美国Alltech公司)。进样器用有机玻璃加工成型,直接柱上进样,能清楚地观察到样品在色谱柱头分配的全过程。1.3色谱柱的流型观察为了使色谱柱呈透明状态,我们对流动相进行了选择,使填料与流动相的折射率相近。图1为采用环己烷和乙醇作流动相时的色谱柱照片。由图1可发现,用环己烷作流动相的色谱柱床层呈透明状态(图1-b),这是因为填料和环己烷的折射率分别为1.46和1.42,二者相近;而乙醇的折射率为1.36,与填料的折射率相差较大,因此床层不透明(图1-a)。为了观察柱内样品谱带的真实流型,避免由于圆柱形或圆锥形柱管产生的类似透镜的效果而使观察到的流型发生严重变形,我们将有机玻璃柱浸入盛有丙三醇的方形容器中。丙三醇与有机玻璃的折射率分别为1.474和1.49,二者的相近可以消除由于介质与有机玻璃柱折射率的差异使观察到的流型产生变形的现象。1.4流速和检测波长的选取进样:为了能清晰地观察到样品谱带的流型,并且不使样品谱带的纵向宽度过大,实验选取有色的10g/L碘的环己烷溶液,进样量为80μL。流速:随着流动相流速的增加,色谱柱所受压力随之增加,样品谱带流型的纵向宽度也增加。考虑到色谱柱可以承受的压力以及流型的可观察性,实验采用的流速小于12mL/min。检测波长:碘的环己烷饱和溶液在波长520nm处有最大吸收,但由于制备液相色谱的进样量较大,当使用分析型紫外检测器时,为防止检测信号饱和,选取吸收较弱的波长作为测量波长。本实验选取的测量波长为460nm。2结果与讨论2.1色谱柱的筛选分别采用孔径均为20μm的多孔烧结不锈钢和多孔PTFE作为色谱柱的筛板材料,比较了台锥形柱在不同流速下的柱效(以理论塔板数表示)(见图2)。结果表明,采用多孔PTFE作为柱头筛板材料的色谱柱,其柱效比用多孔烧结不锈钢作为筛板材料的色谱柱柱效低约40%。这是因为:多孔PTFE筛板硬度较小,流动相及样品以一定流速流经该筛板时,使其产生一定程度的变形,而筛板局部各处的变形不一定均匀,致使样品流经该筛板后流速在径向各点上不相等,造成谱带的径向扩散。2.2流型的使用与柱效关系由于目前市场上提供的商品筛板直径有限,许多色谱工作者常常使用外套聚四氟乙烯环或聚醚醚酮(PEEK)环的不锈钢筛板。我们在台锥形色谱柱柱头上采用两种筛板,一种是外套PTFE环的不锈钢筛板,即PTFE环外径为20mm,内部包围直径为14mm的多孔烧结不锈钢(孔径20μm);另一种是无环的多孔烧结不锈钢筛板,筛板直径与柱入口内径一致(20mm)。比较了分别使用这两种筛板时的台锥形柱内样品谱带的流型(图3)及其柱效(图4)。图3表明,使用不同直径的筛板产生了截然相反的抛物线流型。这是因为样品流经多孔筛板与聚四氟乙烯环时受到的阻力不同。当使用直径与台锥形色谱柱柱头内径相同的无环多孔不锈钢筛板时,样品通过色谱柱柱头筛板时各处流速相等,因此最初的流型平直(见图3-a的第一个流型),样品沿色谱柱向下移动后,由于锥形柱斜面的存在,受到剪切力、摩擦力及管壁支撑力在轴向分量的影响,样品在柱管壁区流速加快,使流型呈现开口向下的抛物线型(见图3-a的后几个流型)。而使用有环筛板时,样品先从环内的多孔不锈钢筛板流出,然后向径向扩散,造成中心区流速高于管壁区,呈现开口向上的抛物线流型(如图3-b所示)。由图4可以发现,无环筛板的柱效高于有环筛板