手性物质分离分析方法及其应用-2010

手性物质分离分析方法及其应用1第一节手性的概念及手性物质分离意义第二节手性物质分离分析的一般方法第三节手性色谱分离分析法第四节手性分离分析方法的应用2第一节手性的概念及手性物质分离意义3一、手性及对映异构体1、手性的由来

1848年，微生物学之父法国科学家路易斯·巴斯德(Louis

Pasteur)在显微镜下发现两种酒石酸盐的晶体形态。

这两种晶体的关系就好像一个物体与它在镜子中的映像一样，拥有相同的物理化学性质，但其水溶液能够使偏振光的偏转方向不一样，一种左偏转，另一种右偏转。4更为奇妙的是，当把这两种晶体的溶液等量混合以后，偏振光不发生偏转。由此，巴斯德断定酒石酸分子拥有一种镜像物质，它们彼此的旋光性相反，具有不同的空间构型。

1904年，英国物理学家，开尔文勋爵(Lord

Kelvin)在巴尔的摩的一次演讲上第一次提出了手性的概念(Chirality)，并且定义为任何一个不能与其镜像完全重叠的几何构型或者点群都可以说其具有手性。5

物体与其镜像不能叠合的现象称为手性(Chirality)。

两种互为镜像关系且不能重叠的分子称为手性分子，或对映异构体(Enantiomorph)。2、手性及对映异构体的定义互为对映体的手性分子63、手性分子的特点

手性分子或对映异构体的结构差别很小，具有相同的熔点、沸点、偶极矩、折光率和光谱性质等。与非手性试剂作用时，其化学性质也一样，很难用一般的物理或化学方法区分。

但它们对平面偏振光的作用不同：一个会使平面偏振光向右旋，称为右旋体；另一个可使平面偏振光向左旋，称为左旋体，二者旋转角度相同。因此，对映异构也叫做旋光异构。7二、手性物质的分离意义1、“反应停”事件

1953年，瑞士的一家药厂首次合成了一种名为“反应停”的药物。经研究发现，反应停具有一定的镇静安眠的作用，而且对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳。于是，反应停便于1957年正式被推向了市场。此后不久，反应停便成了孕妇的理想选择，在全球被医生大量处方给孕妇以治疗妊娠呕吐。8因母体使用反应停而致畸性的儿童但后来，欧洲的医生们发现该地区畸形婴儿的出生率明显上升。到了1961年出现畸形胎儿约万例，这其中有近4000名患儿活了不到一岁就夭折了。反应停化学名称为沙利度胺(Thalidomide)，分子中具有一个手性中心，其R异构体对孕妇具有镇静和安眠用，而S异构体则会无一例外地导致胎儿畸变。9两种构型具有不同活性的手性药物102、分离意义

手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。作为生命活动基础的生物大分子如蛋白质、多糖、核酸都具有手性的特征。目前人类用于治疗各种疾病的化学药物很大一部分具有一个到两个手性中心。它们的药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配与分子识别来实现的。许多研究表明，往往是一种立体异构体有药效，而它的镜像分子药效很小，甚至完全没有药效或具有相反的药效。11

除药物之外，涉及面很广、用途各异的各类精细化学品，如杀虫剂、杀菌剂、昆虫性信息素、植物生长调节剂、食品添加剂、香料等，其分子的光学异构体也常表现出不同的生理活性。因此，研究互为对映体的手性物质的物理化学性质，获得单一的对人体和环境有益的手性对映体单体，使得手性分离分析技术的研究与发展显得十分必要。12第二节手性物质分离分析的一般方法131、手性源合成法2、结晶拆分法3、化学拆分法4、酶拆分法5、膜拆分法6、萃取拆分法7、色谱拆分法（下一节着重介绍）14一、手性源合成法

手性源合成法是以单一对映体的手性化合物为原料合成另外的手性化合物的单一对映体，这是化学家最常采用的方法。

由于原料的立体结构决定着产物的立体构型，所以获得制备所需对映体的手性原料就成为这种方法的关键。但是天然手性物质的品种和数量毕竟有限，满足不了实际的需求。同时利用天然手性物质衍生出所需的手性化合物，反应的步骤较多、难度也较大。15二、结晶拆分法

结晶拆分法是基于对映体与纯手性物质形成非对映体盐或共价衍生物，然后利用非对映体的性质差异进行分离(如分级结晶)，再将衍生物还原为纯对映体。结晶拆分法分为晶体机械拆分法和接种结晶拆分法。

晶体机械拆分法是将外消旋混合物从溶液中结晶析出，依据两种对映体结晶形态的差别，从结晶物中进行手工分离。这一方法耗时费力，仅能应用于实验室研究。16

接种结晶拆分法是采用加入纯对映体之一的晶种，将附在播入的晶种上的同种对映体析出的分步结晶分离方式。虽然结晶拆分法操作简单，但其要耗费大量的时间、劳力和物力，而其实验与预期存在很大偏差，因此应用面并不广泛。结晶拆分法实例17三、化学拆分法

此方法是通过化学反应的方法，即用手性试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映异构体之间物理化学性质的不同将二者拆分开。拆分成功的关键是选择合适的拆分剂。

合适的拆分剂应该是能够与对映体生成非对映异构体，且溶解度差别较大，经拆分后，又易再生为原来的对映体。18虽然这种方法一直被作为重要的拆分方法，但其局限性也很明显：（1）拆分剂和溶剂的选择较为盲目；（2）拆分的产率和产品的对映纯度不高；（3）适用于手性拆分的对映体的类型不多。19四、酶拆分法

酶对光学活性异构体有选择性地进行酶解作用，使外消旋体中一种光学异构体酶解较快，而另一种酶解较慢，或者不发生酶解，并在适当的条件下被保留而达到分离。

酶催化拆分的主要途径为主体选择性水解、酶化和转酶作用。

20酶催化的副反应很少、产率高、反应的条件也较为温和，而且酶无毒、易降解、不会造成环境污染。但该法仅能适用于酶促反应体系，另外酶制剂品种有限、酶易被破坏不稳定、制剂的价格较高也阻碍了其应用发展。21五、膜拆分法

氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来完成的，这种转移的对映体选择性非常高，膜法拆分对映体正是这种生物过程的模拟。

在各种膜技术中，选择性比较好的是使用流动载体的液膜。在液膜中，具有手性选择能力的载体溶解于某种液体溶剂之中，通过与某个异构体特异性的结合，将其从上相转移到下相，从而实现对映体的分离。但是由于液膜稳定性较差，其工业应用一直受到很大的限制。22为了克服液膜的不稳定性，固膜得到了很大的发展。在固膜中，不同的对映体是通过选择性扩散或吸附来完成跨膜过程的。

选择性扩散固膜一般都不带有特殊的手性拆分剂，形成选择性扩散的原因是一种异构体比另一种异构体在固膜中更容易扩散。

选择性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母体中的手性拆分剂与对映体之间特殊的分子间作用来进行手性拆分。通常一种异构体被较多的选择性吸附在手性拆分剂上，而另一种异构体则较多的游离在聚合物母体之中。23由于选择性与透过通量之间的反比例关系，选择性扩散固膜的应用受到了限制，只有通过扩大膜面积或者增加平衡级数来弥补，这在实际应用中很不经济。而选择性吸附固膜可以在选择性和透过通量两方面同时提高，从而使其在手性拆分工业中的大规模应用成为可能。24六、萃取拆分法

萃取拆分法是利用萃取剂与拆分物中两对映体的亲和作用力的差异或化学作用的差异来进行拆分的一种新型方法。目前有三种萃取拆分分离体系，即亲和萃取拆分体系、配位萃取拆分体系、形成非对映立体异构体萃取拆分体系。

萃取拆分法除具有传统液液萃取技术的特点,适用性强、效率高、成本低、可连续化操作外，还可以实现萃取拆分过程与外消旋化反应一体化。25在拆分过程中使没有应用价值的对映体能连续地转化成所需要的对映体，使外消旋化产生的所需对映体萃入萃取相，萃余相中富集的无应用价值的对映体进行外消旋化反应，从而克服了单纯外消旋过程的严重缺陷。与传统的萃取过程相比，其最大的区别在于拆分过程中所选择的萃取剂是具有手性的。因而，萃取剂的选择也是拆分过程中的关键。26第三节手性色谱分离分析法27

随着现代科学技术特别是仪器分析技术的发展，科学家们已经把注意力集中在手性化合物的色谱分离方法的研究上。色谱法是最可靠和最常用的测定低含量对映体杂质的方法之一，并且是唯一能测定复杂基质中对映体纯度的方法。

同时，色谱法很容易实现对映体的大规模制备。色谱技术已成为当前手性分离的主要工具，手性分离也成为色谱科学的重要的研究对象。

一、手性色谱分离技术28

常用于手性分离的色谱技术包括：薄层色谱法(TLC)气相色谱法(GC)毛细管电泳(CE)超临界流体色谱法(SFC)高效液相色谱(HPLC)模拟移动床色谱技术(SMB)（用于对映体大规模制备）291、薄层色谱(TLC)拆分法

TLC是最简便的色谱技术之一，具有操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观、能快速更换流动相系统等特点，已在化学、化工、生化、医药卫生等各个领域广泛使用。尽管手性固定相价格、紫外背景、显色剂等原因使的目前能用于TLC的手性载体和能被TLC分离的手性化合物很少，但可以预见它将会成为手性拆分的重要手段之一，在光学异构体的分离、分析及光学纯度的测定中发挥重要的作用。30手性固定相薄层板常用的有:(l)纤维素板及预涂纤维素的薄层板；(2)浸渍手性选择剂的手性薄层板；(3)分子印迹薄层色谱手性固定相；(4)将手性选择剂化学键合到载体上，进行对映体分离的化学键合手性薄层板，主要有环糊精键合相薄层板、Prickle型薄层板等。312、气相色谱(GC)拆分法

气相色谱法是对映体拆分的一个重要手段。目前气相色谱中用于分离对映体的固定相主要有三类：手性氨基酸衍生物光学活性的金属配合物环糊精手性固定相。32优点：流动相简单分离度和柱效高适合拆分一些不带芳香环的对映体化合物（这类对映体在液相色谱条件下通常很难被分离和检测）缺点：一般要在较高的温度下进行，而这易导致手性选择剂的消旋化，从而降低其手性识别能力可分离的对映体有限，一般只能分离易于气化和热稳定性高的对映体化合物。333、毛细管电泳(CE)拆分法

毛细管电泳具有简便、高效、试样用量少和和几乎没有废液的特点。CE作为一种简单快捷、经济方便的现代技术，在药物分析和临床医学研究中得到了越来越广泛的应用。毛细管电泳法分离对映体时，一般是将手性选择剂添加到缓冲液中，对映体分子可与手性选择剂形成具有不同稳定性的复合物，导致迁移速度差异而得到分离。34

手性化合物分离的CE模式按分析对象在溶液中较常用的有毛细管区带电泳法(CZE)

胶束电动色谱法(MEKC)

毛细管电色谱法(CEC)

毛细管区带电泳法CZE是CE中最基本、最普遍的一种模式。各类手性试剂加入到缓冲液中，实现多种手性异构体的分离。35

胶束电动色谱法(MEKC)涉及电渗电泳和色谱分配过程，在缓冲液中加入表面活性剂形成胶束相，分离机理为分析物在水相和胶束相中多次分配以达到分离目的。胶束体系可分为单一胶束、混合胶束和微乳体系。

CEC是将固定相填充于毛细管柱内或涂布、键合于其内壁，以电渗流或电渗流结合压力流推动流动相、溶质，根据它们在固定相和流动相之间的分配及自身电泳淌度的差异而得以分离。364、超临界流体(SFC)拆分法

超临界流体色谱法以超临界流体（例如液体CO2）为流动相对化合物进行分离，该技术常被认为是气相色谱法和液相色谱法的补充。与气体流动相相比，超临界流体对样品的溶解度高。与常规的液体流动相相比，超临界流体粘度低，扩散系数大。SFC分离对映体常用的手性固定相有环糊精类、多糖类和氨基酸及酰胺类手性固定相。37

具有分析速度快、选择性好、柱效高等优点。适合于热稳定性差以及低挥发性物质的分析。由于其具有很好的环境友好性，因而将在药物及代谢产物、天然产物、油脂及食品、农业与环境样品分析等诸多领域发挥一定的作用。优点：对仪器要求较高，普及性较差，这在一定程度上限制了该技术的应用。缺点：385、高效液相色谱(HPLC)拆分法

基于手性固定相的液相色谱技术在过去的20年中取得了较大的进展，目前已经成为药物研发领域最为重要的对映体拆分技术。据统计，目前已有1300多种液相色谱手性固定相被发展出来，其中至少200种已经有商品化的产品出售。高效液相色谱手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、适用范围广(可以用于对热稳定性差和极性农药的分析)且分离能力强，成为了手性药物分离的首选技术平台之一。39高效液相色谱较气相色谱和电泳技术应用广泛的原因，一是由于所有药物进入生物体都是经由生物体的体液来运输而进一步产生作用而决定的，所以几乎所有手性药物都能在高效液相色谱方法中找到适合于其本身特点的分离环境;二是高效液相色谱更易实现生物样品的在线预处理，能实现高度的自动化，已经发展成对映体分离比较迅速的领域之一。40液相色谱用于对映体分离有直接和间接两种方法直接法手性流动相(chiralmobilephase,CMP)将手性添加剂加入到流动相中，与溶质的对映体生成一对非对映络合物，在普通色谱柱上进行分离。优点：无需柱前衍生，对色谱填料无特殊要求。缺点：添加剂选择不当会干扰溶质的检测，可拆分的化合物有限。41手性固定相(chiralstationaryphase,CSP)基于样品与固定相表面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分离。优点：制备方便、适用于各类化合物的拆分，是

手性色谱分离对映体的主导方法。缺点：没有一种广谱性的色谱固定相，需根据样品的结构选择合适的手性柱42手性衍生化试剂法，即对映体先以手性试剂衍生，形成非对映异构体后，再在普通色谱柱上实现分离。间接法优点：①分离条件相对简单，只需普通的HPLC条件。

②衍生化后有利于提高紫外或荧光的灵敏度。缺点：①需要高纯衍生化试剂。

②各对映体衍生化速率不同。43尽管间接法在某些情况下可降低成本、提高检测灵敏度，但受制于衍生化试剂(chiralderivatizationreagent,CDR)种类有限以及衍生化反