心肌组织病理学评价心肌内固定治疗大鼠心肌梗死模型的建立

心肌组织病理学评价心肌内固定治疗大鼠心肌梗死模型的建立

为研究缺血性心肌病提供了可能的方法。在选择实验动物和实验方法并确保实验正常时，选择合适的检测方法非常重要。我们必须了解与心脏疾病相关的肌腱和血管再生，并具有组织病理学检查的要求。然而，如果我们想知道这对肝功能的影响，我们需要进行进一步的检测。本研究通过结扎左冠脉前降支的方法,建立稳定的大鼠急性心肌梗死动物模型,并于结扎前后利用MPA多导生理记录仪描记心电图,4周后进行离体Langendorff心脏灌流测定左室心功能和心肌组织病理学检查,评价模型的构建情况,为研究干细胞移植对心肌梗死后的心功能变化提供基础。1材料和方法1.1动物饲养环境成年Sprague_Dawley(SD)大鼠,雌雄不限,体重为(350±50)g[合格证号:SCXK(沪)2003-0002],购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,动物饲养环境为清洁级[饲养设备:SYXK(沪):2004-0005],上海中医药大学动物实验中心。本研究遵循国家实验动物管理条例及国家实验动物管理实施细则。1.2呼吸频率的确定模型组选用SD大鼠16只,用氯胺酮腹腔注射麻醉后,先行气管切开插管并接通微型动物呼吸机(第二军医大学生理学研究所生产,江湾Ⅰ型),待呼吸机参数调整好后(呼吸频率每分钟110~120次,吸与呼之比为1∶1.5),在胸骨左侧4、5肋间开胸,显露左冠动脉前降支,于其中远段1/3交点处(从前降支的起始到心尖部拉一细线,三折后确定中远1/3交点),以8~0proline线直接结扎,进针深度0.2~0.4mm。逐层关胸,清醒后拔除气管插管,送回动物房精心饲养4周。另选仅开关胸后存活的10只SD大鼠作为对照组。1.3评估方法1.3.1病理组织学检测将3根电极分别置于两上肢和右下肢,接MPA多导生理记录仪(上海奥尔科特生物科技有限公司)系统,在冠脉结扎前至冠脉结扎后连续描记心电图。于4周后开胸经下腔静脉注入肝素(0.5mg/kg),剪断上下腔静脉、肺动脉、主动脉(保留1cm左右)及心脏周围组织,迅速取出心脏置于4℃的Krebs_Henseleit(K_H)灌流液(NaCl118.0mmol/L、KCl4.7mmol/L、KH2PO41.2mmol/L、MgSO4·7H2O1.2mmol/L、CaCl22.9mmol/L、NaHCO32.5mmol/L、Glicose11.1mmol/L、EDTA0.5mmol/L,pH7.38~7.46)中,轻轻挤压心脏,排空心脏内残留的血液,立即将主动脉固定于Langendorff灌流装置(上海奥尔科特生物科技有限公司)插管固定器上的一个插管上,经三通开关接K_H灌流液,灌流液以95%O2和5%CO2充分饱和、灌流压约7.9Kpa左右、灌流液温度为35℃~37℃左右。从左室插入尖端带有水囊的导管,然后通过压力传感器,接MPA系统记录左心室最大收缩压峰值(LVPSP)和左室舒张末压峰值(LVEDP)、左室内压等容相最大上升及下降速率(+dp/dtmax,_dp/dtmax)。1.3.2病理组织切下完成离体心脏指标的检测后,迅速取下心脏,进行心肌组织的病理学检查,观察梗死区域的病理变化(由专业人员完成)。1.4统计学处理数据采用均数±标准差表示,利用SAS8.0软件进行统计学处理。对照组和实验组采用组间t检验,差异显著性水平设为a=0.05或者0.01。2结果2.1两种类型的呼吸感染造成患者呼吸衰竭,是造成呼吸严重损害的例数,是造成呼吸被伤害时造成呼吸阻力;术后肺部感染导致呼吸感染本此实验的麻醉效果好,术中呼吸道分泌物少且无麻醉意外发生。呼吸参数设定合适、呼吸机性能稳定。本实验造模成功率为62.50%(10/16),由于不明原因的窦性停搏及室性心动过速致使心脏停跳而死亡2只,术中引起肺部损伤、气管切开出现的凝血块及分泌物引起呼吸道梗阻等导致呼吸衰竭而死亡的例数为3只,而术后肺部感染导致的死亡例数为1只。因实验动物模型手术操作是在心脏不停跳的情况下进行冠脉结扎,易造成心脏损伤,对动物的创伤较大,严格的无菌操作和熟练的手术技能可减少动物的死亡率。2.2心电图标志的建立心电图检测以两个以上导联出现ST段呈持续性抬高、降低、至出现病理性Q波为模型建立成功的心电图标志。本实验显示结扎前呈正常心电图表现(图1),打结后可见左室前壁及心尖部颜色变暗、搏动减弱,此时即出现ST_T融合波抬高;在结扎30min后可观察到病理性Q波的出现(图2),提示心肌梗死模型制作成功。2.3两组hr、dp、dtx、lvedp对比表1所示Langendorff离体心脏灌流装置系统检测结果:与对照组相比,实验组的LVSP(t=3.6550,df=18.0,P=0.0018)、+dp/dtmax(t=_2.6816,df=18.0,P=0.0152)与_dp/dtmax(t=2.9394,df=18.0,P=0.0088)降低;LVEDP(t=4.4574,df=18.0,P=0.0003)升高,两组相比差异极显著;而两组HR差异不显著(t=0.4261,df=18.0,P=0.6751)。提示大鼠心肌梗死模型建立成功4周后左室心功能显著下降。2.4纤维组织化常规HE染色后,在显微镜下观察可见心内膜下存活心肌细胞岛状分布,心肌纤维排列紊乱,心内膜下纤维肉芽组织增生,坏死心肌被纤维组织取代(图3,见后插页Ⅰ)。3离体心脏灌流实验动物模型在分子生物学、病理生理学和细胞学等方面为心血管疾病的诊治提供了丰富的参考资料,转基因技术和组织工程学的发展使动物模型能够用于进一步的疾病机制和技术的探索,而大鼠作为研究心血管疾病的动物模型已得到公认。急性心肌梗死后,一部分心肌细胞坏死,一部分心肌缺血,活力降低,梗死相关冠状动脉再通后,由于大量的氧自由基等产物造成心肌缺血再灌注损伤。目前,有关干细胞移植治疗急性心肌梗死和缺血性心肌病所致的慢性心功能不全的基础和临床研究已经有报道,在改善心功能和减轻病理损伤方面都有一定的效果,为进一步研究干细胞移植的治疗机制和近、远期疗效,必需有一个稳定可靠、重复性好、且更有适用于测定其心功能变化的动物模型。在体情况下,心脏功能受前后负荷及心率等的影响,且后者又受神经体液的调控,因而很难准确评价各种干预性措施对心脏功能的影响,离体心脏灌流实验将动物心脏取出,连接到特定的灌流装置,用灌流液灌注,排除了神经和体液的控制,配合特别为心功能研究设计的MPA心功能分析软件记录心室内压、动脉血压和心电信号,自动分析数十项参数,用于病理生理情况下的心功能与血流动力学改变等研究,在生理、病理生理以及药理学研究中已得到广泛地应用,大鼠离体灌流心脏模型是研究心肌收缩特性和心肌代谢的适宜方法。本研究用结扎法建立大鼠心肌梗死模型,4周后采用Langendorff离体心脏灌流及其连接的MPA多导生理记录仪对该模型的心功能进行检测,为研究干细胞移植对大鼠心肌梗死后的治疗作用提供基础。心肌梗死是一个冠脉结扎后心肌组织缺血程度逐步加重而导致细胞变性坏死的病理过程,结扎冠脉后,由结扎冠脉直接供血的心肌很快死亡,而周围组织可接受附近血管的血液供应,不会即刻坏死,但随着缺血的加重梗死区逐步向外扩展。一般情况下,缺血20~40min后心肌组织发生不可逆的损伤。在本实验中我们结扎左冠脉前降支30min后,心电监测出现病理性Q波,说明模型构建成功。本研究制作心肌梗死模型时采用的心脏原位结扎法,心脏处于正常解剖位置,对心脏生理功能影响较小,但视野小、操作困难、创伤较大,故选择体重稍大、体质健康者的动物为宜;因为SD大鼠对麻醉药较为敏感,剂量稍高、注射稍快,易导致呼吸抑制而死亡,应严格控制给药剂量和速度;SD大鼠心脏对各种刺激均较为敏感,更易发生室颤而死亡,因此,术前给予利多卡因预防室颤;动物死亡多发生在插管、结扎至拔管1h内,少数可发生在心肌梗塞后24h,操作需谨慎、细致和严密观察,本实验中动物的存活率与国外文献报道相似。4周后构建适用