小鼠冠状动脉缺血再灌注损伤模型的建立

小鼠冠状动脉缺血再灌注损伤模型的建立

心脏疾病的发病率和致死率在全世界呈上升趋势。心肌缺血再灌注(I/R)动物模型的成功建立为缺血性心脏病治疗提供必需的实验方法,其模型复制方法目前有两种:无呼吸机支持胸腔外结扎和呼吸机支持改进的心脏原位结扎法。2008年12月~2009年12月,本研究结合使用小鼠呼吸机,对心肌I/R模型的手术技巧和注意事项进行简述,以期熟练掌握手术方式,快速准确地建立高存活率动物模型。1小鼠呼吸道感染后辅助开腹手术1.1实验动物野生型C57BL/6雄性小鼠购买于Jackson实验室(美国缅因州BarHarbor),共30只,其中20只用于建立I/R模型(实验组),10只为假手术组。所有的实验操作获得美国俄亥俄州立大学动物保护和使用机构的许可,并且符合美国国立卫生研究院相关实验动物使用和保护指导(NIH85-23,1996)。1.2主要试剂及仪器氯化三苯四氮唑(TTC,美国Sigma公司)。药品有氯胺酮、阿托品、甲苯噻嗪和异氟烷。小鼠通气量呼吸机,心电图监测仪,3-0和7-0丝线,显微外科手术器械,小动物体温监测器,红外线加热器,心脏切片器,麻醉机,激光多普勒灌注检测仪。MetaVueVersion6.2r6分析软件,高分辨率解剖显微镜(Nikon,SMZ1000)。伊文思蓝(EvansBlue,美国Sigma-Aldrich公司)。1.3动物模型的改进参考文献的方法并加以改进。具体方法如下:小鼠用氯胺酮(50mg/kg)合并使用肌松剂甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉。为控制呼吸道分泌物,术前给予阿托品。待小鼠麻醉后,采用PE-90号插管做气管插管,采用内外芯结构,将插管套在内芯为20G钝性钢针外。肉眼直视观察到气管插管针进入气管后缓慢推动至器官分叉上方,拔出内芯,与小鼠呼吸机连接。调节小鼠潮气量维持在250~300ml/min,控制呼吸频率在110~130次/min。采用红外线体温加热器维持体温在36.5~37℃。开胸手术:小鼠采用右侧卧位,暴露左侧腋窝,从左腋窝下缘做横行切口至左胸骨旁剪开皮肤,距离胸骨中线约2mm,整个横行切口大约8mm,皮下血管电凝结扎止血。逐层分离,剪断胸大小肌,适当电凝止血。暴露胸壁肋间隙,在第4或第5肋间隙钝性分离肋间肌,进入胸腔。采用自制拉钩,以四角撑开肋间隙暴露范围6~8mm,可根据手术需要适当调整大小。剥离心包膜充分显露左心耳及左心室。在左心耳与肺动脉圆锥之间,找到行于心肌内与心大静脉走向一致的冠状动脉左前降支(LAD),以7-0无损伤缝针距离左心耳下缘2mm左右穿过心肌表层,在肺动脉圆锥旁出针。待稳定15min后,在心脏表面结扎处放一长约2mm,大小为10号的聚乙烯管,在其上作一活结以结扎LAD,心电图显示ST段弓背向上抬高,心脏表面相应区域原色变为苍白表明缺血成功;在30min缺血后,PE管被移出,LAD重新开放,心脏表面由苍白变为鲜红表明心肌组织恢复再灌注。再灌注时间根据实验需要可设置不同时间点;再灌注开始后,缝合肋骨,逐层缝合肌肉和皮肤。剪断门齿挂线,松开四肢及尾部固定。待小鼠苏醒四肢有力时,方可拔出气管插管。根据TTC染色需要,我们在再灌注后24min处死小鼠。假手术组开胸后,仅将缝针穿过LAD,但不做结扎。1.4梗死面积计算I/R24h后,采用腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠,剪开胸腔切取心脏,保留主动脉。将心脏保存于4℃生理盐水中,将23号针头置入升主动脉根部,不穿过主动脉瓣,结扎固定。准备37℃3~4ml的TTC磷酸缓冲液(pH7.4),从主动脉缓慢灌注心脏,当心肌变为砖红色时停止注射。重新结扎LAD。然后通过主动脉均匀缓慢灌注约2ml2.5%的伊文思蓝,并使心肌缺血区域面朝上,防止流出的蓝污染心脏表面。待心脏变蓝后停止灌注并用生理盐水充分冲洗,清洁心脏表面并挤压心脏以排除残留于心腔中伊文思蓝。充分吸干心脏表面和心腔中的生理盐水,保存于-20℃冰箱中。待心脏冷冻固定后,将心脏置于切片器中,从心尖开始连续切厚度为1mm的切片,一共5片。采用高分辨率解剖显微镜对每片心肌组织两面进行拍照。采用MetaVueVersion6.2r6分析软件对切片分析,TTC染色后梗死区为白色,未梗死区为砖红色,伊凡思蓝染色后整片切片面积减去蓝色区域为缺血危险区(AAR)。以AAR/左心室区域(LV)百分比表示AAR面积,梗死区/AAR百分比表示梗死面积。完毕后对每片心肌组织称重。1.5统计学方法AAR和缺血梗死区面积结果以x¯±sx¯±s表示,采用Sigmaplot11.0做t检验。以P≤0.05为有统计学差异。2结果2.1模型准备实验组因麻醉意外死亡1只,成功率为95%(19/20)。假手术组均存活。2.2心电图st段的变化实验组结扎LAD后心电图QRS波高大增宽或ST段弓背上抬,复灌后ST段下降1/3以上,假手术组前后无变化。2.3面积比较表1经过TTC和伊文思蓝染色,实验组和假手术组AAR面积分别为(59.5±0.9)%、(60.7±1.1)%,P>0.05;实验组梗死面积为(32.2±0.7)%,假手术组无心肌梗死形成。3心外膜的外膜下边缘的开腹模型I/R模型中采用无呼吸机支持胸外结扎法因心脏挤压至胸腔外,严重影响心脏的电生理和泵功能,影响实验结果的可靠性,尤其在心肌缺血预处理时,多次牵挤心脏导致死亡,造模成功率极低。在我们的实验方法中,合理使用小鼠呼吸机,操作过程中心脏处于正常的解剖位置,对血流动力学及心功能影响较小,术后存活率显著提高。必要的设备支持,扎实的手术基本功及必要的手术技巧对成功建模有重要意义。我们还有如下体会:①肋间隙的选择:肋间隙的选择需要根据具体的实验需要具体分析。如缺血前预处理模型的建立,因为短期内需要对心脏反复操作,并且操作位置主要在心耳下缘位置,所以相对单纯I/R模型,在开胸时应适当高出一肋间隙,于第3肋间隙入胸。而在其他手术模型的建立,比如运用电子顺磁共振技术监测心肌中氧分压水平的实验,因为需要在心肌中植入探针,我们选择第5肋间隙进入胸腔。②结扎部位:在我们的手术过程中,一般以左心耳最下缘作为解剖标志点1,以肺动脉圆锥作为解剖标志点2。在距离解剖位置点1下方2mm左右进针,从解剖标志点2出针。这样避免了依靠肉眼寻找LAD的主观性,同时依靠固定的解剖位置,固定的入针出针部位,有效地控制缺血面积的范围,模型重现性好。③进针深度:我们的经验是当使用7-0无损伤缝线的时候,进针深度0.5~1mm,当针尖全部进入心肌组织后,通过腕关节的作用水平化弧,至肺动脉圆锥出,出针;同时,为防止心脏因受进针力量跟随右偏,左手可持手术镊以相反的方向控制心脏的偏移。④结扎松紧度:结扎时宁轻勿重,在手术过程中,只要缺血期间连同LAD一起结扎的10号聚乙烯小管没有松脱,基本可成功建立缺血再灌注模型。如果用力过度会导致缺血后血管无复流现象,在TTC染色切片中表现为整片心肌梗死。另外如果过度用力,会因缝线的切割作用撕裂上方的心肌组织。TTC染色是作为判断心脏受损程度重要方法,此类染料可以穿过细胞膜,可以进行灌注染色。在整个染色过程中我们需要注意的是灌注针不要进入心腔,停留在主动脉瓣上方即可。恰当的控制染料仅局限在AAR而不渗透到正常的心肌组织中成为染色成败的关键