雌二醇对大鼠下丘脑神经激肽b表达的影响

雌二醇对大鼠下丘脑神经激肽b表达的影响

1983年，kanga等人首次从猪骨髓中分离神经激酶b（nk）。含有10个氨基酸,是兴奋性神经肽类中速激肽家族的一员。近期研究发现,编码NKB和其受体(NK3R)的基因TAC3以及TACR3失活突变所引发的人促性腺功能减退症,并出现性腺类固醇和促黄体生成素(Luteinizinghormone,LH)的循环水平降低,青春期延迟,甚至不育。因此探究性腺激素与NKB表达之间的关系可为初情期启动调控机制增加新的调控靶点,同时也为青春期发育相关疾病的病理生理基础和临床研究与治疗提供理论依据。前人研究发现,NKB和NK3R在下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropinreleasinghormone,GnRH)神经元分布的关键区域有较高的表达,如下丘脑弓状核、室旁核和腹内侧核等核团。近期对基因敲除小鼠的相关研究证实,雌激素通过雌激素受体α(Estrogenreceptorα,ERα)介导GnRH的负反馈调节作用,研究表明在人、大鼠和绵羊的下丘脑弓状核NKB神经元中均有ERα表达,而在GnRH神经元未发现ERα表达。以上研究表明,雌激素及其受体在NKB调控生殖方面起着重要的作用。但目前关于NKB研究多停留在不同物种的定位研究上,未见探讨NKB与雌激素在生殖过程中的变化规律。本试验采用卵巢摘除以及雌激素处理等方法,研究不同处理方式下大鼠青春期启动的时间以及下丘脑NKB表达量的变化,旨在为进一步揭示NKB在动物生殖调控中所起的作用及其机制提供形态学参考。1材料和方法1.1麻醉大鼠分组自清源试验动物公司购入15只健康的成年SD大鼠(10只雌鼠、5只雄鼠),进行饲养繁殖,从其所生F1代中挑选40只25d幼龄雌性SD大鼠,随机分成4组:外源性E2处理组(E2组);花生油处理组(C组);卵巢摘除+E2组(OVX+E2组);卵巢摘除组(OVX组);每组10只。腹腔注射2%的戊巴比妥钠进行麻醉,麻醉后在E2组大鼠背部埋植含有100μg/kg苯甲酸雌二醇的硅胶管;在C组大鼠背部埋植含有0.05mL花生油的硅胶管;OVX+E2和OVX组大鼠麻醉后,利用外科手术法摘除双侧卵巢,并在OVX+E2组大鼠背部埋植含有100μg/kg苯甲酸雌二醇的硅胶管。1.2思想上染苯二醇aszh-mas试验截取2.2cm长,内径1.57mm,外径2.41mm的硅胶管(济南晨生医用硅橡胶制品公司),用硅胶专用粘合剂进行一端封口。苯甲酸雌二醇(宁波激素二厂)按1mg/mL溶于药典级花生油(BSZHSCIENCES,P49872)中,根据试验分组将适量的雌二醇用1mL注射器注入硅胶管中,反复甩管避免气泡产生,最后用粘合剂将另一端封口。室温放置24h干燥,干燥后蒸馏水清洗表面,75%的乙醇再清洗1min,室温晾干,环氧乙烷灭菌。1.3冠状连续冰激凌切片的制备继续饲养大鼠,至阴门开启立即麻醉并处死大鼠,取下丘脑置入4%的多聚甲醛溶液中固定12~24h。然后将下丘脑置于30%的蔗糖溶液中固定,制成7μm厚的冠状连续冰冻切片。冰冻切片制备2套,1套做免疫组化染色,另1套做阴性对照。1.4nhpa显色试验做好的切片用PBS浸洗3次,每次10min,用1%Triton(V(Triton)∶V(PBS)=1∶99)孵育10~20min,用牛血清白蛋白(10%)封闭15min,甩去血清,加入NKB(NKB羊抗鼠,SANTACRUZ,sc-14109,1∶200),湿盒内4℃过夜。过夜后的切片用PBS洗3次,每次10min,加入PV-9003试剂盒(北京中杉金桥,K122320D)中的试剂Ⅰ,37℃恒温箱孵育30min,PBS洗3次,每次10min,再加试剂Ⅱ,37℃恒温箱孵育30min,PBS洗3次,每次10min。参照DAB显色试剂盒(北京中杉金桥,ZLI-9032)说明书进行显色,苏木精复染,1%的盐酸酒精分色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。显微镜观察可见免疫组化阳性产物呈棕黄色,阴性对照组一抗用PBS替代,其他步骤同上。1.5观察指标1.5.1门关闭时间每组大鼠阴门开启后立即记录日龄,并计算各组大鼠阴门开启的平均日龄。1.5.2显微镜观察在光学显微镜下观察切片,并用Olympus摄影显微镜BH22采集图像,以获取NKB在大鼠下丘脑的免疫组化阳性反应区域。1.6阳性区域平均光密度值每组随机取5张切片,对免疫组化阳性区域进行拍照,运用Image-proplus6.0软件对阳性区域平均光密度值(Densitymean)进行分析。各组光密度值和大鼠阴门开启时间均用“平均值±标准差”表示,采用t检验分析各组间差异。2结果与分析2.1大鼠阴门开启的时间对大鼠阴门开启的时间进行统计。发现E2、OVX+E2组大鼠比C组大鼠阴门开启的时间显著提前(P<0.01),E2与OVX+E2组的大鼠阴门开启时间差异不显著(P>0.05)。OVX组大鼠至试验结束时阴门仍未开启(处死日龄同C组)(表1)。2.2各组大鼠nhpa表达情况DAB显色后,NKB免疫阳性细胞呈现深浅不均的棕黄色(图1),阳性细胞多呈卵圆形和椭圆形,胞质内呈现棕黄色或有棕黄色微粒附着,胞核内无着色。在E2组(图1(a)、(b)、(c)、(d))、C组(图1(e)、(f)、(g))、OVX+E2组(图1(h)、(i)、(j))和OVX组(图1(k)、(l)、(m))大鼠下丘脑弓状核、室旁核、腹内侧核均出现了NKB免疫阳性细胞表达。OVX组大鼠弓状核(图1(k)-a)、室旁核(图1(l)-b)、腹内侧核(图1(m)-c)中NKB呈强阳性表达。C组(图1(g)-d)和OVX组(图1(m)-d)大鼠室周核也有少量的NKB阳性表达。阴性对照组的免疫反应结果为阴性(图1(n)、(o))。图1(p)为下丘脑整体轮廓图。2.3对大鼠腹内侧核和室旁核nhpa表达的影响对各组大鼠下丘脑不同核团NKB免疫阳性产物相对表达量进行分析(表2)。OVX组大鼠下丘脑弓状核NKB阳性表达显著高于OVX+E2、C和E2组(P<0.05);在大鼠腹内侧核,OVX组大鼠NKB平均光密度值最高(P<0.05),OVX+E2组高于C组(P<0.05),E2组最低(P<0.05);OVX+E2、C和E2组大鼠室旁核NKB平均光密度值均显著低于OVX组(P<0.05);OVX与C组大鼠下丘脑室周核也有少量阳性表达,但二者间差异不显著(P>0.05)。3讨论3.1a大鼠阴门提前开启,a型中的激素对gnrh脉冲发生器阴门开启是判断雌性大鼠初情期启动的重要标志。现有的研究表明下丘脑GnRH出现脉冲式释放是下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-pituitarygonada,HPG)轴正常运行的始动因素和核心物质。初情期的启动则源于GnRH脉冲发生器抑制状态的解除。幼年期是动物生殖系统发育的关键时期,此时机体内源性雌激素水平极低,因此对性激素水平的变化非常敏感。本试验在不消除内源性雌激素的情况下施以外源性雌激素,结果发现E2组大鼠阴门提前开启;在消除内源性雌激素的同时给予外源性雌激素替代,发现OVX+E2组大鼠阴门提前开启。揭示一定量的雌激素可解除“GnRH脉冲发生器”的抑制状态,提前启动雌性大鼠HPG轴。这与Herbison在1998年报道雌激素对哺乳动物GnRH神经元分泌起着至关重要作用的结论一致。近年研究表明,雌激素受体有二种亚型ERα、ERβ,敲除下丘脑的ERα基因后,大鼠无生殖行为和正常动情周期。提示雌激素通过ERα来调节生殖作用。已有的研究证实GnRH神经元上不存在ERα,如果雌激素要想解除“GnRH脉冲发生器”的抑制状态,就必须通过中间神经元来连通二者。有研究发现NKB神经元上存在ERα,提示NKB可能是雌激素调控生殖作用的枢纽。本试验在进一步验证上述结果的前提下又探究了雌激素对下丘脑NKB表达的影响。3.2er与nhp-lh神经元轴突相关研究试验结果表明,NKB主要分布在大鼠下丘脑弓状核、腹内侧核和室旁核。这与前人在小鼠、大鼠、猴、人和绵羊的定位结果一致。下丘脑弓状核、腹内侧核和室旁核是哺乳动物神经内分泌系统的重要核团,也是下丘脑GnRH神经元和ERα主要聚集处。研究证实GnRH神经元仅表达ERβ,说明雌激素负反馈作用可能通过其他神经元上的ERα发挥作用。人类基因研究也确定了NKB及其受体NK3R是正常发育状况下激活下丘脑GnRH脉冲分泌所必需的。根据前人研究下丘脑弓状核NKB神经元投射路径来看,NKB神经纤维有向GnRH分泌的关键区域正中隆起和第三脑室周围的室旁核、室周核处延伸的迹象,且NKB神经元轴突也有向第三脑室周围延伸的迹象。研究发现GnRH神经元轴突可以识别NKB受体。因此,笔者推测雌激素通过ERα与NKB神经元建立联系,产生的调节信号经NKB神经元的投射路径传递到GnRH神经元,刺激GnRH神经元调节生殖内分泌作用,当然这并不是唯一的路径。本试验结果表明NKB在E2组大鼠下丘脑的室周核上也有阳性表达。这与Kalló等人在小鼠上的研究结果相似;但与Rance等和Kauffman等在大鼠上的研究结果不同。设想可能跟物种差异,以及试验动物的处理方法不同有关。对比各组大鼠下丘脑NKB免疫阳性产物的表达量,发现OVX组大鼠下丘脑弓状核上的NKB呈强阳性表达,揭示内源性雌激素干扰NKB的表达,这与Kauffman等和Navaaro等发现的小鼠卵巢切除后下丘脑弓状核内的NKB表达量增加,以及Eghlidi等发现的卵巢摘除的猴子,其下丘脑弓状核NKB出现强阳性表达的结论不谋而合。此外,C组大鼠下丘脑弓状核NKB呈阳性表达,而E2和OVX+E2组大鼠下丘脑弓状核上的NKB免疫反应呈现弱阳性,提示外源性雌激素抑制大鼠下丘脑弓状核NKB的表达。研究证实上述抑制作用并没有发生在ERα基因敲除的小鼠上,推测ERα是雌激素与NKB相互作用的结合位点。近期研究发现NKB激动剂刺激青春期前大鼠分泌LH,并且该结果随后在小鼠、猴、山羊和羊等动物上也得到了验证。然而Kinsey-Jones等发现NKB激动