实验2-UU任一目的基因原核表达载体构建及表达鉴定20160426

UU任一目的基因原核表达载体构建

及表达鉴定

设计性、创新性实验

综合实验室1内容提示1.实验基本原理2.试剂及仪器准备3.操作步骤4.注意事项5.实验意义2一、实验原理DNA克隆又称基因克隆或分子克隆。广义的分子克隆主要包括上游技术（重组DNA技术）和下游技术（基因表达技术）。而狭义的分子克隆仅指重组DNA技术。3基因重组：利用酶学方法将不同来源的DNA分子组装成一个新的重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段4总体技术路线

分（离目的基因）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）

表（达目的基因）5

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线67

解脲脲原体(

Ureaplasmaurealyticum,UU)亦称溶脲脲原体，是六种脲原体属中的一种，与人类泌尿生殖道感染有密切关系。在分类上属支原体科脲原体属。解脲脲原体是人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，在特定环境下可致病。近年来，解脲脲原体所致泌尿生殖道感染日益受到重视，是引起非淋菌性尿道炎的病原体之一。现已被列为性传播疾病的病原体。目前，尚无可行的疫苗供人类使用。本研究为筛选潜在的UU疫苗候选基因奠定基础。二、试剂及仪器准备1．引物设计与PCR扩增试剂，注意选用高保真酶2．酶切载体和目的基因试剂限制性核酸内切酶BamH

Ⅰ和Not

Ⅰ，购至试剂公司，试剂公司附送相应的10×限制性核酸内切酶缓冲液3．载体和目的基因片段回收、纯化试剂DNA片段胶回收试剂盒，购至试剂公司，其组成为：吸附柱、收集管、结合缓冲液（BindingBuffer）、洗脱液（WashSolution）、EB缓冲液（ElutionBuffer）。83．连接反应试剂T4DNA连接酶，试剂公司附送相应的10×T4DNA连接酶buffer。4．大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化。5．重组质粒的筛选试剂（1）Amp母液：取氨苄青霉素钠溶于去离子水中，配成25mg/mL溶液。过滤灭菌，分装储存在-20℃。（2）LB液体培养基。（3）含Amp的LB固体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，琼脂15g，加去离子水800ml，搅拌使其完全溶解，用5mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000ml，高压灭菌20min，冷却至60℃左右，加入Amp母液，使终浓度为50µg/ml，摇匀后铺板，4℃保存。96．异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）将1gIPTG溶于4ml去离子蒸馏水中，定容至5ml，浓度为200mg/ml用0.22μm过滤器除菌，分装成1ml小份，-20℃保存备用，可保持4个月。7．琼脂糖凝胶电泳试剂8．蛋白电泳试剂9．DNAmarkerDL2000；DNAmarkerDL15000。10．标准蛋白Marker11．菌落PCR相关试剂dNTP(2.5mol/L)、TaqDNA聚合酶5U/µl，10×PCRbuffer（含MgCI2，浓度为25mmol/L）、dNTP混合物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mmol/L），均购至试剂公司。1012．通用引物引物序列为：PGEX5’5’-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3’；PGEX3’5’-TATGGCTGATTATGATCAGT-3’。由引物合成公司合成，并根据合成的引物浓度，用灭菌双蒸水将引物稀释至5µmol/L的浓度。13．GlutathioneSepharoseTM4B微珠，购至试剂公司。11三、操作步骤12酶切目的基因与载体连接为重组DNA分子转化入感受态细菌抗药性平板初筛筛选菌落PCR复筛确定为阳性克隆交叉PCR进一步鉴定诱导蛋白表达并SDS鉴定序列分析进行确定在质粒载体上进行目的基因克隆表达的基本步骤是：1.目的基因扩增根据NCBI提供的UU8型株基因组信息，筛选感兴趣的目的基因，并应用primer5

检查是否含有BamH

Ⅰ和Not

Ⅰ酶切位点？是-去掉

示例应用PCR技术获得目的基因。琼脂糖凝胶电泳确定扩增效果。满足要求后使用DNA纯化试剂盒回收目的基因，待用。

13UU8型：全长0.88Mb，含有699个基因，表达650个蛋白质2.目的基因和载体（pGEX-6p2质粒）双酶切

混合均匀后，经离心机快速离心2s，以集中样品，37℃水浴1h。3.酶切后载体和目的基因片段回收、纯化

用DNA胶回收试剂盒回收、纯化载体和目的基因片段。具体方法参照试剂盒说明书。14BamHⅠ（10U/L）

1µlNot

Ⅰ（10U/L）

1µl10×buffer

2µl质粒/目的基因1µgddH2O补足体积至20µl4.载体质粒与目的基因片段的连接

目的基因片段和载体片段按4︰1（摩尔比）进行连接反应，连接反应体系（25µl）。

混合均匀后，经离心机瞬时，以集中样品，16℃反应16～20h，取出，-20℃保存，备作转化实验。5.大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化

取连接产物2µl加入已经制备的-80℃保存的20µlXL1-Blue感受态菌体溶液中进行转化。1510×T4DNA连接酶buffer2.5µl目的基因片段0.4pmol载体DNA0.1pmolT4DNA连接酶1µlddH2O补足体积至25µl6.重组质粒的筛选（1）将200µl转化的菌液涂布于含终浓度为50µg/mlAmp的LB固体培养基表面，置37℃培养箱30min后，倒置平板继续培养12～16h。（2）取出培养板，观察菌落生长情况。（3）菌落PCR挑取选择性培养基上生长的单个菌落，挑其一半制作菌液为PCR扩增模板，以pGEX-6p2上下游引物为扩增引物，菌落PCR反应总体系为20ul，其中10Xbuffer2.0ul，dNTP（2.5mmol）1ul，上游primer(20umol/L)0.2ul，下游primer(20umol/L)0.2ul，TaqDNA酶(5U/ul)0.2ul，模板16.4ul（一般先加）。167.目的基因表达（1）确定为阳性克隆后将剩余半个菌落挑入3mLLB选择性液体培养基(Amp50µg/ml)中，37℃继续震荡培养14h。（2）次日按1:50比例接种于20mLLB液体培养基，同样条件培养约3h至A600达0.8~1.0。17

将各反应体系混匀后瞬时离心，置于PCR仪进行PCR扩增。PCR扩增参数具体如下：94℃预变性5min；95℃变性60s，54℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。（4）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物

取PCR产物5µl，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统观察，判定是否为阳性克隆，并记录结果。8.结果判定

在含有Amp的筛选培养基上，不带有pGEX-6p2质粒DNA的细菌，由于无Amp抗性，不能存活；而含有pGEX-6p2空载体和含有重组质粒（带插入基因片段的阳性重组子）的细菌均能存活。经菌落PCR重新筛选，可获得阳性克隆。在诱导剂作用下重组质粒在工程菌中表达目的蛋白，结合SDS技术可鉴定蛋白表达情况。18（3）加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，30℃诱导培养3h。（4）4℃，5000rpm离心20min，弃培养液收集菌体。（5）加入1mL裂解液，冰浴超声6min裂解菌体；（6）4℃，5000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀，上样进行12%SDS分析，考马斯亮蓝染色后分析蛋白表达形式，确定融合蛋白为可溶性蛋白或包涵体膜蛋白。四、注意事项1．酶切载体和目的基因的注意事项：（1）酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶切反应。（2）酶切要在适宜温度下进行（常为37摄氏度）。（3）紫外光对DNA分子有切割作用，若需要从胶中回收DNA做测定，应尽量缩短照射时间，并采用长波长紫外线（300-360nm）。（4）EB为强诱变剂，且有毒性，配置和使用时应戴手套，并注意环境卫生，避免实验室污染。192.质粒载体与目的基因片段连接的注意事项（1）在粘性末端连接时，除载体与目的基因连接构成重组体外，还有一定数量的载体自身环化形成空载体，这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景。为了增加重组的比例，一般将目的DNA片段的摩尔数控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。（2）选用品质好的T4DNA连接酶，实验中取酶时，应将酶放在冰盒上，用完立即放回-20℃冰箱保存。商品化的连接酶反应缓冲液购买后，最好先分装，-20℃保存，以减少反复冻融的次数。203.大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞的制备和转化的注意事项：（1）全程注意无菌操作，防止杂菌和杂DNA的污染。（2）用于转化的质粒DNA浓度与质量要有保证，需为共价闭合环状的DNA分子，一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。21（3）连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但在此温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，因此在实际操作时，一般采用12℃～16℃，此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。4.SDS的注意事项（1）处理样品时需沸水浴3min左右，以除去蛋白质亚稳态的聚合（2）PAMF、APS等试剂有一定的神经毒性，需注意生物安全。（3）灌胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。22（3）转化温度（42摄氏度）及转化时间一定要控制准确。（4）转化菌涂布平板时培养时间不能超过16小时，否则抗生素会被消耗掉，未转化菌也会生长。五、实验意义使同学们基本掌握基因克隆与表达技术，为进一步的分子生物学研究奠定基础。克隆出UU基因并表达其蛋白，为后续研究UU的生物学特征奠定基础。23[1]童伟,张战军