酶活性浓度的测定技术

第五章诊断酶学DiagnosticEnzymology第四节酶活性浓度的测定技术

体液中酶的测定是临床生物化学检验的一项重要内容。二十世纪50年代人们用分光光度法建立了连续监测酶活性浓度方法，到60年代特别是80年代以后，由于各种工具酶和酶分析试剂盒的生产与普及，自动和半自动生物化学分析仪的引进和应用，使得各种体液酶的测定在方法学与临床应用方面有了长足的进步与发展。一、概述正常人血中大部分酶一般在pg（10-12克）到ng（10-9克）水平，要直接测定这种微量酶蛋白是十分困难的。常用的酶学测定方法则利用酶有加速化学反应（催化）的特性，通过测定被加速化学反应的反应速率，根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量来计算酶活性浓度的高低。这种浓度的确切名称是“酶的催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。按监测方法分类可分为量气法、分光光度法、荧光法和放射性核素法、电极法和其他方法。以分光光度法最为常用。1．量气法测定原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量。适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，如氧化酶反应涉及氧气的消耗，脱羧酶会产生二氧化碳等。此法操作烦琐，灵敏度低且技术要求高，临床实验室很少采用。2．分光光度法从50年代起采用分光光度法取代比色法，其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质。结合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)H和NAD(P)＋吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。3．荧光法和放射性核素法对于一些酶浓度很低的标本，用普通的分光光度法往往测不出来，此时可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以NAD(P)＋为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。4．其他方法当酶促反应涉及酸碱变化时，可用pH仪或电位滴定仪测定酸碱度变化来计算酶浓度。这类方法需要一定仪器，操作麻烦。此外，各种电极法、旋光法、极谱法、高效液相色谱法或生物发光法等也可用于测定特定的酶或进行酶学研究。Note极谱法（polarography）通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流-电位（或电位-时间）曲线来确定溶液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。二、酶活性浓度测定方法测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。（一）酶促反应进程如将酶促反应过程中测得的产物[P]或底物[S]变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线（图6-2）。图中产物[P]或底物[S]变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。大多数酶促反应进程曲线表明，在酶促反应一开始的阶段，底物[S]浓度不断下降，随之有相应产物[P]产生。但由于各种因素的影响，反应速率比较慢，这段时间称为延滞期（1agphase），可以是几秒至几分钟。尤其是双底物反应或需要辅酶参与者，通常为1～3min。随后在过量的底物存在下，反应速率加快并达到一个反应速率稳定的阶段，即酶促反应以恒定的速率进行，不受底物浓度的影响，这段反应称为线性反应期（1inearphase）或零级反应期（zeroorder）。产物[P]和底物[S]与时间t成线性关系。随着时间的延长，由于种种因素，如底物因酶反应消耗而浓度下降，产物浓度上升出现逆反应，反应产物可能有抑制酶反应作用或酶的热失活等，使酶促反应变慢，即反应速率下降，偏离线性，这段时间称为一级反应期（firstorder）。反应速率与底物[S]成正比，产物[P]与时间t不成线性关系。如果反应速率受两种或两种以上物质浓度的影响，则反应可为一级、二级或多级反应，一般将这段反应时间统称为非线性反应期。图6-3显示单试剂速率法酶促反应进程曲线。为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度，否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果不准确，一般结果偏低。（二）酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法（fixedtimeassay）和连续监测法（continuousmonitoringassay）两大类。1．定时法这是早期测定酶活性浓度的方法。大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样法”、“终点法”或“两点法”。用此类方法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。图6-4显示定时法中酶促反应的三种可能过程。虽然从t1到t2三种反应所生成的产物量相同，但实际反应过程有很大差别。曲线1说明酶促反应速率接近终点时已经减慢，曲线2说明在反应早期存在延滞期。只有曲线3时，用定时法可以准确测定代表酶活性浓度的反应速率。因此，用定时法准确测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，避开延滞期和一级反应。2．连续监测法连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。在以往的一段时期里，常把这类方法称为“动力学法”或“速率法”。这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。连续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，因而测定结果也较取样法准确。三、连续监测法测定酶活性浓度随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。（一）连续监测法的种类1．直接法这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的一种。利用NAD(P)H在340nm处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在260nm波长和340nm波长处有吸收峰，而氧化型NAD＋／NADP＋只在260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。340nm波长处吸光度的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减。A+NAD(P)＋B+NAD(P)H脱氢酶还可利用一类人工合成的所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。ABC酶促反应显色反应2．间接法直接法虽然简单，但只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。目前可采用两类间接法进行酶学测定。一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清ChE（胆碱酯酶）的丁酰硫代胆碱测定法。另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。（二）酶偶联反应最简单的酶偶联反应（单底物反应且只有一个工具酶）模式为：ABC被测定酶（Ex）催化的反应称为始发反应；产生被检测物质产物C（如NADH）的反应称为指示反应，相应的偶联酶（第二个酶）酶称指示酶（Ei）。ExEi如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：ABCD一般习惯将最后一个酶称指示酶（Ei），其他外加的酶称为辅助酶（Ea）。个别情况还可能使用两种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为酶偶联体系。ExEiEa临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物NADH或NADPH于340nm处吸光度的变化速率，可以很容易地监测指示酶反应。用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干扰物质充分进行反应，将试剂中的NADH变为NAD＋。二是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物B开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率Vx，这一时期称为延滞期。随着产物B增加到一定程度时，Ex和Ei反应速率相同，达到了稳态期。此阶段340nm波长处吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反应速度又复减慢。图6-5显示酶偶联法测定ALT时吸光度变化的扫描图谱。设计或选择酶测定方法时，如用酶偶联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。当然也不是所有酶都适合用酶偶联法进行测定。为了保证准确测定酶活性，酶偶联反应的反应速率应超过或等于测定酶的反应速率，指示酶反应必须是一级反应，即指示酶反应速率应和测定酶的产物B浓度成正比。只有当使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小时，才能做到这一点。一般说来酶偶联法中所用的指示酶Km值都很小，酶促反应最适pH应与工具酶的反应最适pH相接近。当然在选用指示酶时还应从经济方面考虑选用一些来源容易且价格便宜的酶制剂。（三）干扰因素临床测定酶活性浓度标本都是体液，其中除测定酶外，还存在着其他各种酶和其他物质，因此在实测反应中可能出现一些副反应或旁路反应，这些都会对测定反应产生干扰。1．其他酶和物质的干扰反应体系各成分除可能引起测定酶反应外，还有可能引起其他酶的反应而干扰测定。例如酶偶联法测ALT时，由于反应体系中含有大量NADH和LD(H)，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。又如红细胞中腺苷酸激酶（AK）对CK测定的干扰，在CK测定的酶偶联体系中ADP是CK的底物，但它又同时是AK的底物，二个酶反应都产生ATP。ATP在试剂中与己糖激酶（HK）和G6PD作用会形成NADH引起340nm波长处吸光度的上升，出现CK酶活性结果偏高。为避免此干扰，一般在反应体系中加入AK的抑制剂腺苷酸（AMP）和二腺苷五磷酸（AP5A）。2．酶的污染因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取，易污染其他酶，如不设法除去将引起测定误差。如组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。使用的酶制剂（如工具酶）必须提纯。例