PCR技术及其应用-1

PCR技术及其应用PCR技术原理5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目录Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C实验仪器电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽电泳技术（２）鉴定DNA分子量(3)胶回收纯化DNAlow-meltagarosePCR仪PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）凝胶成像系统PCR的类型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不对称PCR㈨差异显示PCR㈣共享引物PCR㈩重组PCR㈤锚定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA

锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。

基本概念增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。多重PCR

巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究

高浓度引物低浓度引物PCR技术应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变(

制备杂交探针)遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱诊断遗传疾病肿瘤感染性疾病，传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定,

犯罪现场标本分析大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因基因工程产品×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析RLFP分析法PCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。

PCR-SSCP过程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子

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解链构像DAN原理过程DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究

高浓度引物低浓度引物反转录PCR技术基因mRNA蛋白质多肽链逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析必须在扩增后用电泳方法分