生物竞赛-生物化学-44重组DNA技术-杨荣武《生物化学原理(第二版)(三)》教学课件2

生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武生物化学原理分子生物学)梧荣武可指京大NANJINGUNIVERSITY生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武第四十四章重纽DNA技术生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武提纲重组DNA技术简介基因克隆的详细步骤基因克隆的应用四.聚合酶链式反应五.蛋白质工程六.研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法七.研究蛋白质之间相互作用的主要方法SELEX技术九.生物芯片技术○.基因组学研究概述生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武重组DNA★重组DNA也称为基因克隆或分子克隆,是通过某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成嵌合体分子,并进行扩增和纯化以供进一步研究的技术。★有效的基因克隆至少满足五个条件:(1)具有容纳外源基因或序列的载体;(2)具有将外源基因或序列导入载体的工具;(3)具有合适的宿主细胞;(4)具有将重组DNA引入到宿主细胞的途径;(5)具有选择和筛选重组体的方法。生物竞赛一步物化学原理(分子生物学外源克降载体DNA目的基因载体DNA连接目的基因嵌合体DNA将DNA导入到宿主细胞分离含有重组DNA的细胞宿主细胞克隆基因表达克隆基因表达的蛋白质重组DNA技术的基本步骤生物竞赛一生物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣基因克隆的载体载体的作用是容纳被克隆的目标基因,以便将它们带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。★一种理想的载体至少包括:①大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区,以便于在原核系统中的扩增;②某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区,以方便在真核细胞内的自主复制;③含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点,以方便各种克隆片段的插入和建立DNA文库④带有抗生素抗性基因或其它选择性标记,有利于克隆的筛选和鉴别;⑤某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强子序列,有利于控制被插入的基因在转染细胞或转基因动物内的表达代的体体劲量爱:同时兼顾到克隆目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武Eco010912674BstAPI179datll2617SspI2501Ndei18BegI2215MCS(多克隆位点Scai217736pUC18/192686Gsul17341626cr10l17791466Eco31l1766Eaml10511694复制起始区pUC18/19质粒的基本结构生物竞费一物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武非必需区域与噬菌体外壳蛋白和尾部蛋白包装(右臂)RL(左臂)心R黏性末端限制性内切酶消化与外源DNA连接感染性的噬L4菌体颗粒杂合DNAλ啦菌体载体的构建、重组和包装生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武pBACe3.6SacBⅡ(11.5kb)EcORI酶切,去除中间片段与外源DNA连接启动子SSacBⅡ细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入生物竞赛一步物化学原理(分子生物学)一南京大学杨荣武CEN4TRPIPYAC3(11.4kb)Smai+