冰冻切片步骤很全面之欧阳治创编

欧阳治创编2021.03.10欧阳治创编2021.03.10冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。欧阳治创编2021.03.10欧阳治创编2021.03.10欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编2021.03.102021.03.10欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编2021.03.102021.03.10时间2021.03.10 创作：欧阳治取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）,如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-&）°C冰箱贮存备用。固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于

欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编2021.03.102021.03.10其上，4°C冰箱预冷5-l()min让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架(PE)±30mino切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-l()^mo切片时，低温室内温度以-15°C〜-2()°C为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。切好室温放置30min后，入4°C丙酮固定5〜l()min,烘箱干燥20minoPBS洗5minX3o进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5〜lOmin,消除内源性过氧化物酶的活性。免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,可用含1()%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可不洗)滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且

欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编欧阳治创编2021.03.102021.03.10保证整个过程中不会使组织干涸），将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4°C过夜。第二天先将湿盒放到37°C回温lh,然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37°C孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5minX3次。滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）o回收DAPI,滴加5-1抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封