免疫学实验指导书

免疫学实验指导刘佳斌编生命科学学院

生物技术系2005.3动物的注射采血及血清制备家兔采血有耳静脉采血，耳动脉放血，心脏采血和劲动脉放血法，耳缘静脉采血一般适用于只需少量血液，常用于免疫注射采少量血，测其效价，心脏采血和耳动脉采血法，耳缘静脉采血一般只适用少量采血。常用于免疫注射采少量血，测其效价。心脏采血和耳缘动脉采血可采大量血有能保存动物，从动脉可采大量，动物死去。兔一般采血20ML不影响其存活。鸡一般用心脏采血法，每只鸡一次取血20ML，不影响其存活，经3—6个月后，可再次采血。注射途径一般有皮下、静脉、皮内和腹腔。一、 目的与内容：（一） 目的学习动物不同部位的采血方法练习对家兔耳静脉的注射方法用离心法制备血清（二） 内容1、 鸡心脏采血2、 家兔采血3、 制备血清二、 材料与用品（一） 材料兔、鸡（二） 用品生理盐水、注射器、剪刀、镊子、试管、离心管、离心机三、 操作与观察（一） 鸡心脏采血1、 固定鸡腿、翅膀，拔取心脏部位羽毛，用手将鸡按定。2、 寻找内肋骨到肩胛部皮下静脉，心脏在此静脉分支下面，以食指触摸心跳，消毒，垂直刺入针头，如触及肋骨则稍后退，将针头稍后偏于胸骨，切不可硬往里插，针头向里刺入后，可感到心脏跳动。此时，针头刺入心脏，徐徐抽取血液。采血20ML取下针头，将血液放入离心管。（二） 家兔采血1、家兔心脏采血（1） 固定兔，剪取左前胸心脏部位的毛，酒精棉球消毒皮肤。（2） 用左手食指、中指、无名指防在右胸处，轻轻向左推，将心脏推至左恻固定，拇指在胸左恻由下向上数至第三至四肋骨探测心脏搏动最剧烈处（3） 将针头从搏动处刺入心脏，若准确徐徐抽取血液，足量后拔除，再改变方向成径直刺入心脏，取血液20ML，放入离心管。（4） 家兔静脉注射，在耳缘静脉注入1ML生理盐水。2、家兔耳缘静脉采血。（三）制备血清四、作业与思考1、 心脏采血关键什么？需要注意哪些问题？2、 抓兔子时为什么不能抓它的双耳？正确的抓取方法是什么？抗原与免疫血清的制备将抗原注射入动物体内，刺激动物的B淋巴细胞转化为浆细胞，产生特异性抗体。待其血清中累积大量抗体时，采其血液分离血清，即抗体的免疫血清。抗原量低到一定程度时，抗体不能产生或用现有方法不能测出，但超过最高限度，又对抗体产生抑制作用。本实验抗原为细菌细胞，采用每毫升含9亿个细菌比较恰当。一、 目的与内容（一） 目的1、 抗原与抗体的制备方法2、 为凝集实验制备材料（二） 内容1、 抗原的制备2、 免疫血清的制备二、 材料与用品（一） 材料大肠杆菌，家兔（二） 用品麦氏比浊管，试管，注射器，9号、7号针头，离心机等0.5%的石炭酸生理盐水三、 操作与观察（一） 抗原的制备（1） 取5ML0.5%的石炭酸生理盐水，注射大肠杆菌斜面，洗下菌台（2） 用无菌毛细菌滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管（3） 将此含有菌液的小试管放60度水浴箱中1小时，并不时摇动。（4） 取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石炭酸生理盐水4ml（或更多，是原菌液浓度而定），混匀后各比浊管比浊。麦氏比浊法原理：某一未知菌浓度，菌液在投射光作用下用肉眼与某一比浊管比较，如果二者透光度相同，即可目测该菌大致浓度。（5）稀释：用0.5%的生理盐水，待菌液稀释9亿/ml，即等浊于第3支。（二） 免疫血清的制备（1） 注射动物：耳缘静脉注射抗原。（2） 14日采血1ml，分离血清，测其效价，合格即大量采血。（3） 心脏米血（4） 分离免疫血清。

1日0.2m14日0.6m12日0.4m16日2.0m1四、作业与思考在动物体内制备免疫血清为何要多次注射？2.制备大肠杆菌抗原时，使用石炭酸生理盐水和加热60°C1h的目的是什么？环状沉淀反应可溶性抗原与相应抗体反应，在有电解质的情况下，会产生细微的沉淀，称为沉淀反应。环状沉淀反应是使抗原抗体在沉淀管内形成交界面，然后在此交界面处出现一环状乳白色沉淀物，出现此环状反应的抗原最高峰，稀释度为沉淀素效价。一、 目的与内容（一） 目的通过沉淀素的效价测定，学习环状沉淀反应的操作方法及结果观察。（二） 内容鸡血清与免抗鸡免疫血清发生沉淀反应。二、 材料与用品（一） 材料鸡血清、兔血清、免抗鸡免疫血清（二） 用品小试管、1ml吸管量筒、生理盐水三、 操作与观察1.将鸡血清以1：25稀释，去该液1ml，用倍比稀释法稀释为各种浓度（1#1*、2#2*……）分别表示自第1管、第2管中吸取1ml以此类推。）试管号1234567生理盐水/ml11111111：25血清/ml11#1*1#2*1#3*1#4*1#5*1#6*血清稀释液1/501/1001/2001/4001/8001/16001/3200将9个干洁小试管插在试管架上，使直立。用吸管吸取1：2的免抗鸡免疫血清，加入小试管底部，每管约两滴。用另一吸管吸取上面稀释的鸡血清（抗原），按下表加入各管。试管12345i_in。6789免抗鸡（1：2）/滴222222222稀释度鸡血清——1/501/1001/2001/4001/8001/16001/3200生理盐水兔血清量/滴444444444从最高峰稀释度加起，加入时沿壁徐徐加入，使与下层免抗鸡免疫血清之间形成界面，切勿摇动。室温静置15—30分钟，观察试管中的两液面交界处，有无白色沉淀出现。结果记录：由白色沉淀“+”，无沉淀“一”，出现沉淀最大稀释度的试管其稀释度倒数为沉淀素效价。四、作业与思考结果：试管123456789抗原1/501/1001/2001/4001/8001/16001/3200生理盐水兔血清结果该沉淀素效价为试验时为何稀释抗原，而不稀释抗体?玻片凝集反应细菌细胞成红细胞颗粒抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可以看见的凝集块，称为凝集反应。玻片凝集法主要利用抗血清来鉴定未知菌，也可用来显示免疫血清的存在，这是一种定性方法。一、 目的与内容（一） 目的了解血清学反应的基本原则。学习玻片凝集现象。观察凝集现象。（二） 内容兔抗血清与与大肠杆菌发生凝集反应。二、 材料与用品（一） 材料大肠杆菌、注射大肠杆菌抗原后的家兔（二） 用品琼脂斜面、培养物、生理盐水、玻片、接种环、血清三、 操作与观察采集家兔血液10ml，离心，制备抗血清。以1：10用生理盐水稀释抗血清。在玻片一端用小滴管加1滴1：10抗血清，另一端加1滴生理盐水。挑取少许细菌混入生理盐水中，再搅匀，挑取少许细菌混