牛结核病胶乳凝集方法的研究以及临床的初步应用

硕士论文答辩牛结核病胶乳凝集方法的研究以及临床的初步应用汇报内容

一、文献背景及研究目的意义二、研究思路与策略三、试验方法、结果与讨论四、小结与展望五、研究成果一、文献背景及研究目的意义

文献背景结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。据WHO估计全球约有20亿人感染，每年新病例达800-1000万，约300万人死亡。牛结核病被国际兽医局（OIE）定为B类动物传染病。历来是严重威胁奶业健康发展的重大传染病。除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会取得成功。ThewholegeneticsequenceofMycobacteriumtuberculosis一、文献背景及研究目的意义

文献背景我国对奶牛结核执行检疫-捕杀政策；灵敏快速特异的检测方法是有效执行该防疫政策的重要前提；牛结核病的防制主要是采用牛提纯结核菌素进行变态反应检疫；皮内变态反应的缺点:结核菌素成分复杂其特异性受其他分枝杆菌影响而造成假阳性；反复检疫、结核病感染严重、体质低下、牛体内抗体水平较高等都可造成假阴性；文献背景及研究目的意义

研究目的意义本论文旨在建立奶牛结核病抗体检测的有效方法牛结核病乳胶凝集方法(LAT)；以求将LAT、结核菌素皮内变态反应(TST)联合使用，避免TST对病程严重牛的漏检，建立更加科学、客观的根除策略。MbovisMbovisBCG检测机体反应体液免疫细胞免疫IFN-gammaassay检测病原DNA蛋白PCR皮内变态反应感染免疫新结核疫苗细菌培养感染?免疫？二、研究思路与策略

总体策略胶乳凝集方法ELISAPCRmpb70pMD18-T测序双酶切pET-28aE.coliBL21转化原核表达MPB70EDC羧化乳胶颗粒制备0.5％

的乳胶试剂组装成奶牛结核病乳胶凝集抗体检测试剂盒研究思路与策略技术路线三、试验方法、结果与讨论克隆牛型结核分枝杆菌mpb70表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70建立牛结核病乳胶凝集抗体检测方法临床样本检测结果分析讨论试验方法、结果与讨论

本论文中构建的重组载体试验方法、结果与讨论

克隆牛型结核分枝杆菌mpb70用PCR方法克隆牛型结核分枝杆菌mpb70ItemsVolume(μL)模板5引物(10pM)2dNTP(2.5mM)210×Taqbuffer(含Mg2+)5双蒸水36Taqpolymerase0.5总共50试验方法、结果与讨论

表达纯化牛型结核分枝杆菌MPB70把PCR方法克隆的mpb70片段连接到pMD18-T，构建重组质粒，转化DH5а；小提质粒酶切回收mpb70片段并连接到pET-28a，构建重组质粒，然后转化到BL21中，诱导表达MPB70试验方法、结果与讨论

胶乳颗粒偶联蛋白模式图羧化乳胶微球颗粒Carboxyl(COOH)microparticles羧基基团通过水溶性碳化二亚胺（EDC）活化后，再与蛋白质上的氨基基团结合。

建立乳胶凝集抗体检测方法

最佳偶联MPB70蛋白量的确定

在4mL浓度为0.25％的羧化胶乳中，分别加入不同量的MPB70，从10µg、20µg、30µg、50µg递增至150µg，在硼酸缓冲液中室温作用6h后收集上清，经UV－120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量，ThebestquantityoflinkedMPB70protein

建立乳胶凝集抗体检测方法

最佳偶联时间的选择

在1mL浓度为1％的羧化胶乳中，加入150µgMPB70，改变致敏时间，于0.5、1、2、4、6、8、10和12h进行致敏,致敏后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量。建立乳胶凝集抗体检测方法

最佳胶乳浓度的确定

确定上述条件的基础上，在4mL浓度为0.25％的羧化胶乳中，加入150μgMPB70蛋白，改变胶乳最终致敏浓度，使胶乳微球的终浓度分别为2％，1％，0.5％，0.25％和0.125％，在室温作用6h后收集上清，经UV-120分光光度计测定上清中剩余的蛋白量

试验方法、结果与讨论

乳胶凝集方法条件优化的结果确立乳胶致敏MPB70的一系列最佳反应条件：乳胶最终浓度0.5%；EDC与乳胶最佳反应时间为3h；MPB70的最佳致敏量为0.1mg/ml乳胶；MPB70最佳反应时间为6h；以及一系列的缓冲液的离子浓度和pH值等。建立乳胶凝集抗体检测方法

偶联反应终止剂抗原与乳胶微球过度偶联会导致抗原失活，从而降低抗原-微球基质与抗体结合的能力。所以需要在反应体系中引入其它氨基基团以终止偶联反应。常用的终止剂为乙醇胺和甘氨酸。经试验验证乙醇胺的终止效果要好于甘氨酸，故选用乙醇胺作为终止剂，所用的浓度0.1M，剂量为1mL浓度为1％的羧化乳胶中加入50μL，终止时间为15min。建立乳胶凝集抗体检测方法

封闭剂的选择乳胶微球上未结合抗原的位点需要用封闭剂封闭以防止出现非特异性反应，但同时过度的封闭会降低乳胶试剂的敏感性。所以需