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文档简介

靶向Del-1蛋白的肿瘤血管阻断剂与新生血管抑制剂双效抗体药物的制备龙益如王慧指导老师答辩人编辑标题团队成员窦俊14404315白华山14404726黄妤璠14404713刘学成14404818何海龙14404406王敏敏14404729赵雅嫱14404723组长:龙益如14404806Part1Part2Part3研究思路与方法绪论应用前景目录Contents绪论Part1选题背景相关研究状况研究意义1.1选题背景Del-1(developmental endothelial locus-1)最早被发现是一种在胚胎血管生成过程中由内皮细胞分泌的ECM蛋白,具有促进血管形成的作用,是一种重要的血管再生因子和免疫调节因子。四个观点恶性肿瘤成为威胁世界人民健康的致命因素针对肿瘤的预防、检测和治疗的研究成为热点肿瘤微环境和新生血管是近期药物研究的热门靶点Del-1蛋白靶点的发现为药物研发提供新方向1.1选题背景Del-1蛋白含有三个重复表皮生长因子EGF样结构域和两个盘状结构样结构域。其第二个EGF结构域(EGF2)包含一个可结合整合素的重要模体,RGD模体(Arg-Gly-Asp),两个盘状结构域则可结合磷脂酰丝氨酸,特殊的结构决定了Del-1在细胞微环境中发挥的功能。1.Del-1促肿瘤血管生成作用1.2相关研究情况结合αvβ32.Del-1促进肿瘤生长及转移1.2相关研究情况1.3研究意义学术研究意义Del-1作为肿瘤发生发展过程中重要的胞外基质蛋白,抗Del-1蛋白抗体药物的制备,将为该靶点的实际应用提供相应方法,也对肿瘤微环境中其他靶点的研究提供参考。社会效益可用于治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌等癌症肿瘤,为恶性肿瘤治疗提供新的选择,帮助病人减轻病痛,提高其生活质量。经济效益制成制备相应抗体药物可用于肿瘤检测和治疗,将会有很大经济效益。010203研究思路与方法Part2理论依据研究思路可行性说明2.1理论依据3个依据研究的三个理论依据理论依据一理论依据二理论依据三Del-1蛋白在肿瘤微环境中高表达,在正常人组织器官中仅部分部位表达如眼等。Del-1蛋白在肿瘤新生血管生成、抗肿瘤血管内皮细胞凋亡以及肿瘤转移和复发等多信号通路中发挥重要作用。凝血酶原在凝血机制中起到中心作用,且其转化为凝血酶之后才具有相应活性,而凝血酶原和Del-1蛋白在与整合素结合均依赖RGD模体,可能存在共同抗原。单克隆抗体的制备技术和小分子抗体制备方法为我们提供了技术手段。思路ABCDE兵马未动粮草先行切断运粮通道Del-1蛋白靶点抗体导弹亲和力、凝血酶原2.2研究思路DEL-1蛋白的3D构型2.2.1Del-1相关情况2.2.1Del-1相关情况分子量及其特征Del-1蛋白的序列展示2.2.1Del-1相关情况Del-1蛋白中EGF-2的结构域放大2.2.1Del-1相关情况实验所用具体材料2.2.1Del-1相关情况材料动物免疫饲养细胞的制备瘤细胞SP2/0的制备免疫脾细胞的制备细胞融合阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆细胞冻存与复苏单抗腹水的制备及效价的测定1234567982.2.2抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备培养基及血清:胎牛血清、RPMI1640培养基;试剂:HT、HAT、PEG3500、CFA、IFA、DMSO;细胞系:骨髓瘤细胞系SP2/0本校实验室保存;Balb/C小鼠若干;采用盐析法提纯单克隆抗体,对A-J分别执行如下操作,调节样品pH值,加入正辛酸(25ul/l),搅拌30min;室温高速离心(10000g,30min),收集上清液;再加入硫酸铵(40%饱和度);4℃高速离心(10000g,15min),弃去上清液;用PBS溶解沉淀,可得到比较纯的单克隆抗体A-J溶液。1.单克隆抗体的纯化将各株单克隆抗体分别用胃蛋白酶进行酶切修饰,然后采取凝胶层析法-用SephadexG-100分离F(ab’)2,具体操作不再赘述;测定F(ab’)2的分子量、亲和力、特异性、效价等。2.获取纯化的F(ab')2及鉴定2.2.2抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备一、假设小分子抗体与凝血酶原能够结合肿瘤细胞血管Del-1抗体凝血酶原2.2.3筛选满足亲和力条件的抗体酶免疫技术法(ELISA):(1)将单位量Del-1蛋白吸附于固相载体上,洗涤,封阻。(2)用辣根过氧化物酶(HRP)根据过碘酸盐氧化交联法进行抗体标记,将酶标抗体加入孔内。(3)洗涤未反应物。(4)加入底物(TMB)。(5)加入浓硫酸终止反应,测OD值,检测显色反应的程度,记录。(6)加入第二种抗体(单位量),重复前面步骤,直至全部检测完。(7)根据显色程度大小,将抗体按与Del-1亲和力的大小进行排序。2.2.3筛选满足亲和力条件的抗体酶免疫技术法(ELISA):排序后,按亲和力从大到小的顺序,同理用ELISA将抗体与凝血酶原反应,检测反应亲和力,并与上面步骤进行比较,直至筛选出满足“抗体—Del-1亲和力大于抗体—凝血酶原亲和力”的抗体。筛选满足亲和力条件的抗体2.2.3筛选满足亲和力条件的抗体采用酶切法进行酶原修饰,切除酶原无用的基团,同时可减小其分子量,增加穿透性。若所有抗体不满足2.2.4凝血酶原修饰连接采用流式细胞仪确定抗原—抗体结合表位。然后利用基因拼接技术(基因工程),在融合蛋白作用下,将表位与酶原连接,这样就可保证抗体与酶原结合。基因工程凝血酶原可视为载体,筛选得到的抗原表位视为半抗原,用碳化二亚胺法将两者连接,测偶联比。最后用ELISA找到想要的偶联物。蛋白质工程当抗体不满足亲和力条件时采用脂质体包埋法,将脂质体包埋在酶原上,制成多囊颗粒。增加酶原稳定性。酶固定化法根据肿瘤细胞特有的Warburg反应,可将PKM2结合蛋白结

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