酶学及酶工程课3章2节

酶学及酶工程EnzymologyandEnzymeEngineering田维熙教授中国科学院研究生院第三章酶的结构与功能第二节酶的溶液构象测定一、多维核磁共振（NMR)技术多维NMR是测定溶液蛋白质分子三维结构的方法。1971年比利时Jeener首次提出二维核磁共振概念。80年代末开始以二维异核核磁共振测定13C，15N标记的蛋白质。90年代Bax等提出异核三维和四维核磁共振方法。现精度可达2埃分辨率。多维核磁共振的基本原理NMR是以自旋量子数I=1/2的1H，13C，15N等原子的核为探针，检测蛋白质结构信息。在外加静磁场（H0）作用下，自旋量子数不为0的原子核发生能级分裂。当同时将射频磁场H1作用其上，如频率满足关系式：ω＝γH0时，原子核吸收射频磁场能量由低能级跃迁到高能级，称核磁共振现象。其中γ为旋磁比，不同原子核的旋磁比不同，共振频率不同，而有氢谱，碳谱，氮谱之分。多维核磁共振的基本原理在多维NMR实验中是以一串特定时间间隔的90°，180°……等脉冲方式将H1作用到蛋白质样品上。90°脉冲作用期间满足共振频率条件时，原子核吸收射频磁场能量。脉冲关闭后弛豫机制使核由高能态回到平衡态，垂直方向接受线圈会感应出高频衰减信号，检波后再经傅立叶变换，形成核磁共振波谱。其中包含丰富的蛋白质分子结构有关信息，可以正确地测定蛋白质的二级结构和三级折叠。波谱参数：1）化学位移谱线化学位移来自于核外电子屏蔽作用。以系数σ描述所受屏蔽，共振条件公式变为：ω＝γ（1－σ）H0，σ与分子结构及原子核所处化学环境有关。同一类氨基酸中1H，15N和13C位于不同二级结构和三级折叠中时，其谱线产生相应的化学位移。所以它们共振波谱的化学位移反映了蛋白质三维空间结构及局部微环境。化学位移相对无规卷曲，α螺旋中α质子化学位移向高场方向偏移0.39（标为＋1），β折叠中α质子化学位移向低场方向偏移0.37（标为－1）。根据一级结构中α质子＋1或－1密集情况可推断α螺旋和β折叠域。13C化学位移也有类似情况。综合1Hα，13Cα，13Cβ和13C’等4组化学位移情况，可较明确判断α螺旋和β折叠，正确率可达92％。波谱信息：2）J耦合常数核磁距通过电子云间接传递作用产生能量耦合，反映被测核与周围原子核之间通过成键电子传递的磁相互作用。该耦合改变被测核共振条件，使谱线分裂为多重峰。谱线各分量距离表示耦合的强弱，定义为J耦合常数(Hz)。J耦合常数可用来描述蛋白质主链及侧链的构象。邻位质子的耦合常数还与核扭转角有关。Karplus方程给出主链和侧链各键的二面角与J耦合常数关系，由J耦合常数数据可计算各二面角及扭转角，从而给出相应构象。肽键中异核单键耦合常数波谱信息：3）NOENOE，即欧沃豪斯效应，反映原子核自旋之间的偶极-偶极相互作用。蛋白质分子中1H-1H距离小于5Å，核磁共振氢谱中就可观察到NOE信号，强度和质子间距离6次方成反比。所以NOE信号强度提供了蛋白质中氢原子对之间的距离信息。

NOE各二级结构给出的NOE信号具有不同特征。α螺旋相邻残基的酰胺质子间产生强NOE，酰胺氢和α氢、β氢之间产生不同强度的NOE，氢键产生弱NOE。反平行折叠中，相邻酰胺氢和α氢产生强NOE，酰胺氢之间产生弱NOE，反向链酰胺氢之间，与α氢之间等产生中NOE，而平行折叠中NOE信号的出现规律又不相同。该信号可给出丰富信息。多维核磁共振实验蛋白质分子量的增加造成共振波谱加宽和重叠，无法提取结构信息。多维核磁共振克服了该困难，提供了多种有效获得结构信息的实验。多维NMR共振信号是多个频率变量的函数，可有二维、三维或四维频率坐标轴。实验中由专门设置的射频脉冲序列作用，耦合的核发生磁化强度转移或耦合相互作用而交换信息，用以建立化学位移，J耦合常数及NOE相关的信息。脉冲序列包括弛豫延迟时间、准备周期、演化周期、混合周期、检测周期，多次重复。核磁化转移机制1）磁化强度相干转移：耦合核之间通过成键电子传递磁化强度而交换信息。2）磁化强度非相干转移：核之间通过空间的偶极相互作用而交换信息。多维核磁共振方法中，大多数脉冲序列基于磁化强度相干转移，建立1H，13C，15N之间化学位移相关和J耦合常数信息。少数脉冲序列基于磁化强度非相干转移而建立NOE相关。二维同核（1H-1H）COSY实验基于磁化强度相干转移机制。弛豫延迟时间使氢核自旋回到热平衡态(Ix)；准备周期（第一个脉冲）置其非平衡态(-Iy)；演化周期按设置的间隔时间顺序递增，不同的氢核以不同频率共振而有不同的化学位移标记；混合周期（第二个脉冲）内不同氢核自旋间产生相干转移；在检测周期测得自由衰减信号FID，经傅立叶变换得到共振波谱。二维同核（1H-1H）COSY实验二维异核（1H-13C，1H-15N）HMQC实验分子量增加时同核实验灵敏度急剧下降，采用异核实验解决。本实验也基于磁化强度相干转移机制。氢通道180脉冲使氢核化学位移聚焦并消除异核间J耦合。异核通道90脉冲使单量子项转化为双量子项，演化周期内带有异核化学位移标记。经再一个弛豫延迟时间后在检测周期得到被异核化学位移调制的FID信号，经二维傅立叶变换得到二维异核相关谱。二维异核（1H-13C，1H-15N）HMQC实验多维核磁共振实验已有多种二维脉冲序列：二维同核序列有COSY,TOCSY,RELAY,NOESY,E.COSY,P.E.COSY等;二维异核序列有HMQC,HMQC-COSY,HMQC-TOCSY,HMBC,HMQC-NOE,HMQCJ等。三维核磁共振实验的脉冲序列由两个二维实验脉冲序列组合而成。实验中氢核及氮核的自旋演化周期分别独立设置时间间隔递增。可以消除二维波谱中由于兼并造成的交叉峰重叠现象。四维波谱又可克服三维波谱中的交叉峰重叠。三维核磁共振实验多种三、四维脉冲序列1）建立化学位移相关的序列，包括建立主链原子核间，侧链原子核间核主、侧链核间信号联系的三类序列。2）产生质子对间NOE相关的序列。3）提供同核或异核J耦合常数的序列。由多类实验提取各种所需信息，再对共振波谱解析，最终得到蛋白质结构的完整信息。波谱解析：1）序列识别由多维核磁共振波谱提取蛋白质信息，从分析二维平面波谱开始。一个1万分子量的蛋白质，即可产生数百上千个核磁共振交叉峰，首先必须确认它们的归属，称为共振交叉峰的序列识别。首先确定同核化学位移谱中每一峰所属的氨基酸及哪一质子；然后根据NOE峰信息综合分析，如找到连续的NOE和COSY交叉峰连线，就可判断其序列位置。序列识别波谱解析：2）立体定向指认对侧链甲基和亚甲基质子共振立体定向的指认，使提高局部结构测定精度的关键。根据J耦合常数值和NOE信号强弱可对亚甲基两个氢立体定向构象作判断。分子量较大时则用特定的三维脉冲程序的交叉峰强弱估计亚甲基氢的定向。分子量较小的蛋白质的甲基立体定向可用类似的方法指认。对分子量大的蛋白质需借助一些专门的方法。亚甲基立体定向指认两个β亚甲基氢的空间去向有3种主要旋转异构，其J常数值及NOE信号强弱如下构象123Jαβ23.43.412.9Jαβ33.412.93.4NOE(αβ3)强弱强

NOE(αβ2)强强弱NOE(Nβ3)强强弱NOE(Nβ2)弱强强亮氨酸甲基立体定向指认波谱解析：3）NOE交叉峰强度正确测定质子间自旋扩散和交叉峰重叠会提供不正确NOE信号强度。用高维NOE核磁共振实验消除NOE交叉峰重叠现象。在NOE实验脉冲程序中合理设定相关的混合时间有助于缓解自旋扩散问题。NOE交叉峰强度可由积