实验六-POD同工酶的提取分离活性测定定稿

Pleasebequiet,上课了！！小麦幼苗过氧化物酶同工酶的提取、分离实验七学时：9冯丽、石峰1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2、掌握同工酶的概念；3、掌握实验试剂的配制。一、实验目的：

1、同工酶和电泳概念：2、影响电泳的主要因素：3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4、聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：5、凝胶的质量决定因素：6、不连续PAGE的原理：（1）三个不连续性的表现：(2)不连续系统中的三种物理效应：

（3）

浓缩效应产生的原因：

★

二、实验原理:

1、同工酶和电泳概念：（1）同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。（2）电泳是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。二、实验原理:

由有效迁移率μ＝mα＝qα/6πrη，则可推出：（1）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；（2）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；（3）溶液的粘度：

粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；

2、影响电泳的主要因素：

（5）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；（6）离子强度：

离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；（7）电渗现象：

电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；（8）支持物筛孔大小：

孔径小，电泳速度慢，反之则快。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法（2）光聚合法。

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

（1）化学聚合：

引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。

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聚合反应：架橋物造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交错连结自由基形成（1）聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；（2）链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；（3）网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；（4）长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；（5）该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

4、聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：（1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。（2）交联度：

是指凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数，用C%表示。一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。

5、凝胶的质量决定因素：（1）三个不连续性的表现：①凝胶由上下两层组成，两层凝胶的孔径不同；②缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同；③在电场中形成不连续的电位梯度。

6、不连续PAGE的原理：不连续PAGE电泳胶体系统的组成：1电泳系统pH胶体浓度缓冲液上层

(负极)缓冲液2

样本溶液3浓缩胶

6.7

4分离胶5下层

(正极)缓冲液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-HClTris-glycine

8.3

8.0

8.98.3

5%

7%

-

-

-

(2)不连续系统中的三种物理效应：

①电荷效应：酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极以一定的速度泳动。

②分子筛效应:

相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦不同，受阻程度不同，表现出不同的迁移率。③浓缩效应:使待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层。

★浓缩效应产生的原因：（1）两层胶的孔径不同:酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。（2）浓缩胶中产生不连续的电位梯度:在聚丙烯酰胺凝胶中用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCl为强电解质，不管在哪层胶中几乎全部电离，Cl布满整个胶,待分离的酶蛋白加在点样孔，浸在pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl迅速跑到最前面，成为快离子，在pH为6.7条件下解离度仅有0.1－1％的甘氨酸有效泳动率最低，跑到最后面，成为慢离子，这样在，快慢离子之间就形成一个不断移动的界面。在pH为6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布在界面附近，逐渐形成一个区带。

■在浓缩胶中的三个主要作用角色：甘氨酸:pH=8.9负电荷pI=5.96不带电荷Cl-1:蛋白质(酶):小分子大分子■浓缩效应：分离胶浓缩胶样本8.96.7离子缺乏空间ABC++8.0V=I/S1、实验材料：小麦幼苗2、仪器、器皿：(1)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；(2)稳流稳压电泳仪；（3）高速冷冻离心机；（4）电子天平；（5）电冰箱；（6）瓷盘、微量进样器；三、实验材料、仪器和试剂：

3、试剂：

（1）1NHCl：用12N的浓盐酸来配制；（2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）：（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7Tris-HCl缓冲液）：（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅰ）：（5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅱ）：（6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）；（7）核黄素溶液：（8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）（9）40%蔗糖：

（10）pH4.7乙酸缓冲液：（11）样品提取液：（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；

（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加160ml水,加Vc140.8mg,加几滴30%过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套；

1、贮液的配制：2、凝胶的制备：

2.1胶板的制备：2.2分离胶的制备：2.3浓缩胶的制备：3、酶液的制备：4、装槽、点样：5、电泳：6、剥胶、固定、染色：

四、实验步骤：

2.1胶板的制备：

2.2分离胶的制备：

按下表制备分离胶试剂名称分离胶缓冲液分离胶丙胶贮液Ap无离子水体积比1241取用量（ml）36123

胶灌至距梳子齿下端1cm

→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

2.3浓缩胶的制备：

按下表制备浓缩胶

试剂名称浓缩胶缓冲液浓缩胶丙胶贮液Ap蔗糖体积比1222取用量