南京工业大学生命工程与技术概论限选课-基因工程

第六章基因工程及其应用1基因工程的诞生三大理论基础●遗传物质是DNA●DNA双螺旋结构●密码子的通用性●限制性内切酶的发现●DNA连接酶的发现●质粒的发现三大技术基础2高含油量的转基因大豆转基因蔬菜番茄酱基因工程的应用31.1基因工程概念

基因工程：在生物体外，对生物体的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。4基因工程过程示意图②目的基因与载体DNA片断的体外连接②④④筛选出含有重组子的细胞③将重组DNA分子引入细胞③①获得目的基因①⑤外源基因的表达,获得所需要的产物获得目的产物⑤5第一步：提取目的基因目的基因：编码目的产物的基因取出DNA用限制酶切断DNA例如：人胰岛素基因人干扰素基因编码某些酶的基因植物抗病基因等6◆印迹法方法◆逆转录合成法◆聚合酶链式反应（PCR）7

聚合酶链式反应（PCR）是在体外的小试管中通过酶促反应有选择地大量扩增一段目的基因的技术。它把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。PCR扩增仪8聚合酶链反应95℃目的基因37℃95℃55℃72℃72℃55℃/72℃95℃/55℃/72℃第一轮第二轮第三轮（1）变性（2）退火（3）延伸三个步骤9PCR动画演示10将目的基因片断从细胞内提取需要基因的——限制性内切酶。将目的基因与载体连接

需要基因的

——DNA连接酶。第二步：与载体的体外连接

11限制性内切酶分布：从细菌中分离得到。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有2000多种。12点击播放举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。13DNA连接酶连接酶的作用：DNA连接酶是将碱基互补配对的两个黏性末端连接起来，封闭DNA链上的缺口，使之成为一个完整的DNA分子。

连接的部位：可以催化DNA链上的5-PO4与3-OH生成磷酸二脂键。可用于将目的基因与载体的DNA连接起来。

14DNA连接酶的作用过程点击播放15基因工程载体常用的载体：细菌或酵母菌的质粒、λ噬菌体。载体是能将目的基因片段送入宿主细胞的工具。可与包含目的基因的外源DNA片段连接构成重组体，并将重组体导入宿主细胞。

16质粒：细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。PUC118质粒的基本结构17★目的基因与载体连接，构建了重组DNA分子18第三步：导入受体细胞并扩增常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、毕赤氏酵母和动植物细胞等。构造好的重组DNA分子导入受体细胞，若受体细胞是细菌称转化，若受体细胞是动/植物细胞，通常称为转染。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增19第四步：筛选含有重组子的细胞重组DNA分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，有很大差别。表达：指目的基因编码的蛋白质合成。检测方法：1、特殊标记(蓝白斑、抗药性)2、电泳检测是否有所需的DNA片段或蛋白质条带201选择目的基因及载体质粒并酶切2混合连接3连接物转化大肠杆菌4转入平板培养5蓝白菌菌落筛选6转入液体培养获得大量克隆基因将目的基因克隆到大肠杆菌中的步骤21DNA片断的凝胶电泳蛋白质PAGE电泳标准蛋白目的蛋白

细胞破碎液22第五步：获得目的产物23第二节基因工程应用（1）在医药工业中的应用

基因工程药物人胰脏24胰岛素1吨牛胰脏100克胰岛素2000升发酵液100克胰岛素干扰素1200升人血2－3万美元/病人1升发酵液200－300美元/病人含有人胰岛素的大肠杆菌400头牛25（2）在环境工程中应用

美国GE公司构造成功具有巨大烃类分解能力的基因工程菌，并获专利，用于清除石油污染。26（3）转基因植物

1996-2005年，栽培率九千万公顷，产值100亿美元。27转基因食品转基因玉米转