征求意见稿-畜禽肉中食源性兴奋剂和孕激素的测定 液相色谱-串联质谱法

本文件规定了畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量测定的液质联用检测方法。本文件适用于鸡肉等畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过本文的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义4方法原理样品中的被测物经0.5%乙酸乙腈溶液震荡提取，加入氯化钠和无水硫酸镁脱水离心。上清液采用PSA、C18、中性氧化铝和无水硫酸镁净化。采用高效液相色谱串联质谱测定，内标法定量。5试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水5.1试剂5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.1.3无水硫酸镁（MgSO4）：分析纯。5.1.4无水氯化钠（NaCl）：分析纯。5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：优级纯。5.1.6甲酸（HCOOH）：优级纯。5.1.7乙酸铵（CH3COONH4优级纯。5.1.8中性氧化铝（Al(OH)3）：100~200目，层析用。5.1.9N-丙基乙二胺键合固相吸附材料（PSA）：40μm~60μm。5.1.10十八烷基键合硅胶吸附材料（C1840μm~60μm。5.2溶液配制5.2.10.5%乙酸乙腈溶液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混匀即可5.2.20.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.385g乙酸铵用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。5.2.3复溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.2.2）90mL，加入10mL甲醇混匀。5.3标准品45种被测化合物（纯度≥98%）和9种内标物的的中英文名称和CAS号信息见附录A。5.4标准溶液的制备5.4.1标准储备液：准确称取附录A中的标准品适量（相当于各活性成分10mg），精密称定，分别用甲醇适量使溶解并定容于10mL，配置成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。在-18℃以下避光储存。5.4.2混合标准储备液：按照附录B依据化合物的类别将被测物分成7组，用甲醇配置成7个混合标准储备液。所有标准溶液均在-18℃以下避光储存。5.4.3内标混合标准中间液：取组7内标混合标准储备液适量，用甲醇配置成100ng/mL~400ng/mL的内标混合中间液，见附录B。5.4.4外标混合标准中间液：临用前分别取上述1-6组混合储备液1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配置成外标混合中间液，浓度范围时100ng/mL~400ng/mL，见附录B。5.4.5系列标准工作液：移取一定量外标混合中间液用基质空白提取液逐级稀释，并向其中添加等量的内标混合中间液。5.5材料5.5.1净化管：分别称取吸附材料PSA（5.1.9）、C18（5.1.10）、中性氧化铝（5.1.8）各165mg，无水硫酸镁（5.1.3）900mg于10mL螺盖离心管中。5.5.2微孔滤膜：有机系，0.22μm。6仪器和设备6.1超高效液相色谱-四级杆串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；6.2离心机；6.3氮气吹干仪；6.4超声波清洗器；6.5振荡器；6.6分析天平：感量0.01g和0.00001g。7试样制备和保存7.1试样制备肉类样品各约500g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成2份，分别装入清洁容器内，并标明标记。7.2试样保存试样于-20℃以下条件下保存。8测定步骤8.1样品的处理8.1.1提取准确称取粉碎均质后的猪肉样品5.0g（精确至0.01g）于50mL螺盖离心管中，加入40μL混合内标中间液（5.4.3加入5mL水，涡旋10s后，准确加入20mL含0.5%乙酸乙腈溶液（5.2.1振荡提取15min，加入1.0g氯化钠和4.0g无水硫酸镁，快速混匀，继续振荡10min，8000r/min离心5min。8.1.2净化移取上清液10mL于装入净化剂的净化管中（5.5.1），振荡10min，8000转/min离心5min。准确移取上清液5mL，置于氮气吹干仪上45℃吹干，加入1.0mL复溶液（5.2.3），涡旋复溶，用0.22μm微孔滤膜过滤，待上机测定。8.1.3基质空白提取液的制备称取不含被测物的阴性肉样品5.0g（精确至0.01g），不加内标，按照8.1.1和8.1.2的方法进行前处理，得到空白基质提取液，用于配制标准工作曲线。8.2空白试验不称取试样，按7.1.2和7.1.3的步骤做空白实验。8.3仪器分析条件8.3.1液相色谱条件a)色谱柱：WatersAcquityBEHC18反相液相色谱柱（2.1mm×10mm,1.7μm）或同等柱；b)柱温：30℃;c)进样量：5μL；d)流动相：A为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.2.2），B为甲醇（5.1.1）。梯度洗脱条件见表1。表1HPLC梯度洗脱条件时间（min）A（%）B（%）00.39550.50.39550.3906.00.330708.00.3209.00.300.300.39550.39558.3.2质谱条件a)电离源：电喷雾正离子模式（ESI+）；b)检测方式：多重反应监测（MRM）；c)毛细管电压：0.5kV；d)锥孔电压：30V；e)脱溶剂气流速度：650L/h；f)脱溶剂气温度：450℃;g)锥孔气流速：150L/h。h)45种目标化合物及9种内标物色谱峰的保留时间及质谱参数见附录C，标准溶液特征离子质量色谱图见附录D。8.4定性判定用液相色谱-串联质谱法对试样进行定性判定，在相同试验条件下，样液谱图中应呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的色谱峰保留时间偏差在±2.5%之内；试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表2规定范围，则可以判断试样中存在对应的目标物质。…（1）表…（1）相对离子丰度/%>5020~50（含）10~20（含）≤10允许的相对偏差/%±20±25±30±508.5定量测定在高效液相色谱-串联质谱联用分析条件下，将5μL系列标准工作溶液（5.4.5）按浓度从低到高的顺序依次注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，记录峰面积、保留时间等信息。以基质标准工作溶液中目标物峰面积与对应内标峰面积比为纵坐标，目标物浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品溶液进行定量，计算试样目标物的上机浓度。标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样液含量超过标准曲线范围，则应重新取样测定。9结果计算和表述试样中各被测物含量按照式（1）计算：X=式中: mX——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg）；c——从标准曲线计算得到的目标化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品的称样量，单位为克（g）；4——前处理过程引入的稀释因子。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留一位小数。10方法准确度、精密度和灵敏度10.1准确度本方法的回收率范围是60%~120%。10.2精密度本方法的批内相对标准偏差≤20%,批间相对标准偏差≤20%。10.3灵敏度当称样量为5.0g时，本方法的定量限见附录D。序号中文通用名称英文通用名称CAS号分子式1克伦特罗clenbuterol37148-27-9C12H18Cl2N2O2妥布特罗tulobuterol41570-61-0C12H18ClNO3班布特罗bambuterol81732-65-2C18H29N3O54克伦丙罗clenproperol38339-11-6C11H16Cl2N2O5喷布特罗penbuterol36507-48-9C18H29NO26克伦塞罗clencyclohexerol157877-79-7C14H20Cl2N2O7马布特罗mabuterol56341-08-3C13H18ClF3N2O8溴布特罗brombuterol41937-02-4C12H18Br2N2O9西马特罗cimaterol54239-37-1C12H17N3O氯丙那林clorprenaline3811-25-4C11H16ClNO奥西那林metaproterenol586-06-1C11H17NO3沙丁胺醇salbutamol18559-94-9C13H21NO3齐帕特罗zilpaterol117827-79-9C14H19N3O2莱克多巴胺ractopamine97825-25-7C18H23NO3沙美特罗salmeterol89365-50-4C25H37NO4阿替洛尔atenolol29122-68-7C14H22N2O3普萘洛尔propranolol525-66-6C16H21NO2美托洛尔metoprolol37350-58-6C15H25NO3氨苯喋啶triamterene396-01-0C12H11N720螺内酯spironolactone52-01-7C24H32O4S21坎利酮canrenone976-71-6C22H28O322睾酮testosterone58-22-0C19H28O223诺龙nortestosterone434-22-0C18H26O224去氢甲睾酮methandienone72-63-9C20H28O225勃地酮boldenone846-48-0C19H26O226群勃龙trenbolone10161-33-8C18H22O227雄烯二酮4-androstene-363-05-8C19H26O228脱氢表雄酮prasterone53-43-0C19H28O229甲基睾酮methyltestosteroneC20H30O2序号中文通用名称英文通用名称CAS号分子式30美睾酮mesterolone1424-00-6C20H32O231美雄诺龙mestanoloneC20H32O232司坦唑醇stanozolol10418-03-8C21H32N2O33地塞米松dexamethasone50-02-2C22H29FO534氢化可的松hydrocortisone50-23-7C21H30O535波尼松龙prednisolone50-24-8C21H28O536可的松cortisone53-06-5C21H28O537波尼松prednisone53-03-2C21H26O538醋酸氟轻松fluocinoloneacetonide67-73-2C24H30F2O639氟氢可的松fludrocortisone127-31-1C21H29FO540倍氯米松beclomethasone4419-39-0C22H29ClO541孕酮progesterone57-83-0C21H30O242醋酸美伦孕酮melengestrolacetate2919-66-6C25H32O443醋酸甲羟孕酮medroxyprogesteroneacetate71-58-9C24H34O44417α-羟孕酮17α-Hydroxyprogesterone68-96-2C21H30O345甲地孕酮megestrol3562-63-8C22H30O3I-1克伦特罗-D9clenbuterol-D9129138-58-5C12H9D9Cl2N2OI-2莱克多巴胺-D5ractopamine-D590274-24-1C18H18D5NO3I-3沙丁胺醇-D3salbutamol-D31219798-60-3C13H19D3NO3I-4甲基睾酮-D3methyltestosterone-D396425-03-5C20H27D3O2I-5睾酮-D3testosterone-D377546-39-5C19H25D3O2I-6勃地酮-D3boldenone-D3361432-76-0C19H23D3O2I-7孕酮-D9progesterone-D915775-74-3C21H21D9O2I-8氢化可的松-D3hydrocortisone-D3115699-92-8C21H27D3O5I-9地塞米松-D5dexamethasone-D5358731-91-6C22H24D5FO5序号被测化合物储备液浓度(μg/mL）中间液浓度（ng/mL）组别对应的内标物1克伦特罗1克伦特罗-D92妥布特罗13班布特罗14克伦丙罗22005喷布特罗16克伦塞罗17马布特罗22008溴布特罗19西马特罗2200氯丙那林1奥西那林1沙丁胺醇1沙丁胺醇-D3齐帕特罗1莱克多巴胺1莱克多巴胺-D5沙美特罗1阿替洛尔1克伦特罗-D9普萘洛尔1美托洛尔1氨苯喋啶2200莱克多巴胺-D520螺内酯2200勃地酮-D321坎利酮2200睾酮-D322睾酮220023诺龙220024去氢甲睾酮220025勃地酮2200勃地酮-D326群勃龙220027雄烯二酮2200序号被测化合物储备液浓度(μg/mL）中间液浓度（ng/mL）组别对应的内标物28脱氢表雄酮2200甲基睾酮-D329甲基睾酮220030美睾酮820031美雄诺龙2200孕酮-D932司坦唑醇2200地塞米松-D533地塞米松4400氢化可的松-D334氢化可的松440035波尼松龙440036可的松440037波尼松440038醋酸氟轻松440039氟氢可的松440040倍氯米松4400孕酮-D941孕酮220042醋酸美伦孕酮220043醋酸甲羟孕酮2200睾酮-D34417α-羟孕酮2200甲基睾酮-D345甲地孕酮2200I-1克伦特罗-D91/I-2莱克多巴胺-D51/I-3沙丁胺醇-D31/I-4甲基睾酮-D32200/I-5睾酮-D32200/I-6勃地酮-D32200/I-7孕酮-D92200/I-8氢化可的松-D34400/I-9地塞米松-D54400/序号目标化合物保留时间(min)母离子(m/z)子离子碰撞能(V)碎裂电压(V)1克伦特罗4.56277.42634203.12妥布特罗4.97228.4172.2*3班布特罗368.772.2*34294.4204克伦丙罗2.83263.3203.1*26265喷布特罗7.31292.5236.3*7274.2206克伦塞罗3.81319.4203.1*203681.1267马布特罗5.02311.4217.2*2420237.28溴布特罗4.96367.4132.3*4626293.19西马特罗2.64220.4160.2*24氯丙那林4.51214.3154.2*26奥西那林2.20212.32220沙丁胺醇2.86240.4148.2*齐帕特罗2.82262.4185.2*24202.2莱克多巴胺4.21302.52626沙美特罗7.31416.791.2*3825380.6阿替洛尔2.87267.4145.2*262074.222普萘洛尔5.94260.4183.2*序号目标化合物保留时间(min)母离子(m/z)子离子碰撞能(V)碎裂电压(V)美托洛尔4.75268.5氨苯喋啶4.43254.4443820螺内酯7.10341.5107.2*264891.14821坎利酮341.5107.2*285891.15222睾酮7.49289.520482223诺龙7.20275.5109.2*282239.324去氢甲睾酮7.31301.5262625勃地酮7.06287.5263026群勃龙6.98271.4199.2*22624427雄烯二酮7.19287.597.2*20342428脱氢表雄酮7.49289