邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性

邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性，对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA量等因素对测定结果的影响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶，它能催化超氧阴离子自由基(02—)发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(02—),是生物体重要的细胞防御系统之一，具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效［1］，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景，激起了人们广泛的研究热情.自1969年McCord等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase简称SOD)以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用.经典的邻苯三酚法是Marklund等［2］于1974年发表的一种通过比色测定SOD的简便方法•此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用.与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性.为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH及所含的EDTA量等因素对测定结果的影响进行了探讨.1原理在碱性条件下，邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系.SOD加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD活性的理论依据.2材料与方法(1)2.1试剂和主要仪器试剂0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/LEDTA)：0.2mol/LTris(内含4mmol/LEDTA)100ml与0.2mol/LHCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用；所用试剂均为国产分析纯；实验用水为自制双蒸水；二、 仪器：721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)操作方法2.2方法2.2.1邻苯三酚自氧化速率的测定在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25°C恒温20min后加入25°C预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm处每30s测定一次吸光值A0裘：邻无三断白瓦化谡率測宦加样表D-lmolAiTrij-HCllDnunQl/LHCl总雀积如】对照i:4.?4.20.3—S.04,54.2一荒终液川.，?0一一2一雄fniHurx .H/ilj-t-H2.2.2SOD活力的测定SOD活性测定法按上述表1操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1相同，所测吸光度为-一讦=(A,,- .|：.}/Ah\方法2：、试剂及其配制:1.pH8.2,100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液（内含2mM二乙基三氮基五乙酸）。以加200mM三羟甲基氨甲烷-二甲胂酸钠50ml（内含4mM二乙基三氮基五乙酸）加200mN盐酸22.38ml，然后用双蒸水稀释至100ml。2.10mN盐酸3・6mM邻苯三酚，用10mN盐酸配制，4°C保存。4•实验用水均应用玻璃双蒸水二、仪器：721型分光光度计（上海第三分析仪器厂）操作方法1•邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25C保温劝分钟，然后加入25C预温的邻苯三酚（对照管用10mMHCI代替），迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。表1邻苯三酎自氧化速率测定加持表试 剂加样屋（皿»殻烬浓豉50.pHS-2和血~pH$.2100mM:胫甲基貫基甲垸匸甲肿戯詁绫冲液供舍岔二乙基三氨基五乙1双蕪水+.2030.292.SOD或粗醉抽提液的活性浏定：测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。表2皐OQ或粗亟抽提液活力测定加样表加祥量g）f赧络浹度「I■坯」1OUrriAtr匚於甲毘氨XE甲丈彳二尸脚濮钠绩4锻〔旳在曲餾-:乙皋三頭華五乙酸[4.ft•_..50,pfia.21m.W—乙華酸）3D或相胸册提液O,1--4.1EniAf郛茶三龄幣液0.：30.2总注积 ]-■"-―■■ n—--酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。⑴单位沾力和険洁戈/的计算0.060-单位活力——nx反应液总体积* 讐霧琴畫敎总活力=单位活力W/F订〉乂惊液总体积（巧蛋口浓度（mg/ml）和总蛋片的计算SO1?或粗酶抽提液，经380run紫外比色测定后「查牛血清白蛋白的标准曲线」由此算岀每ml含“g蛋白的量，蛋白浓度=吨蛋白门rdx巒液稀釋倍数xlO-^mg蛋白金1总®白=mg馥白/mix原液总体积=皿号蛋白<3>比活C^/rng蛋白〕的计算扌注— 单位适力Cn/ml'）比淪 蛋白说愛&请靈百7云巧'逸适戈L_/恵蚕百-"&萤白邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，从实验来看，邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出o易一，生成带色的中间产物。反应开始后溶液先变成黄棕色，几分钟后遂转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。我们测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，在这阶段，中间物的积累在滞后30~45秒后，就与时间成线性关系，一般线性时间维持在4,~411511。中间产物在4幼nm时有强烈的光吸收，在有超氧物岐化酶存在时由于它能催化O玉一与H十结合生成0:和HZO:,从而阻止了中间产物的积累，因此通过计算就可求出SOD的活性。邻苯三酚自氧化结果见图1.°。迦昉■町冋〔牯IE2°。迦昉■町冋〔牯IE2阳对自塑也潼窜肾筋m姦gph雲靳总惓机为曲山邻苯三酚为罠皿鸣卯匕总体机为9咄：邹苯三静为山2血乩~n三莪甲基範基甲烷匸甲解嚴钠盪禅液为闻甲基竝甲整二甲牌卿訓溉（内（为含二乙基三気基五乙转）， 余：此苛一乙廉_肖斥£工劉，邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，而在酸性环境中却相当稳定。为了尽可能使缓冲液的pH维持恒定，要求加样量尽可能少些，因为PH变化对自氧化速率有较大的影响，见图2实验表明:不同pH对滞后时间和线性维持时间影响不大，而对线性速率影响很大。实验还表明，降低pH要比升高pH对速率影响更大。测定时，要求将反应液pH严格控制在8.2，误差不得超过士0.01。二、不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率的影响:图3和图4都表明:不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率有影响。在一定的范围内，线性速率随邻苯三酚浓度的增加而增加，见图3,这是本法的优点之一。这样，我们就可在较大范围内选用邻苯三酚的浓度，以便更显著地

观察邻苯三酚被SOD抑制的情况。根据图4的关系表明在温度和pH不变情况下，可以灵敏地检测贮存的邻苯三酚溶液的自氧化程度，以便决定要否新鲜配制。三、温度对邻苯三酚自氧化的影响实验表明，温度对邻苯三酚自氧化速率的影响远比pH要小得多。特别在25一27.5°C时，其影响差别小于4%,基本上不变化。这对测定带来方便。本法测定的灵敏度与经典的黄嗓吟氧化酶法基本相同。3不同邻苯三酣敢度下的自轨化曲线懸*邻菸三前氓度与目竄化速率关柬曲线25弋；,囲甘靳总体积为PrnJ：三宛甲慕氮基甲烷r邪叱*屈乩盍总休积为9ml：三