邻苯二酚加氧酶的发酵及提纯1

邻苯二酚加氧酶的发酵及用双水相法的分离提纯摘要：本实验以苯酚降解菌一种假单胞菌为菌种发酵获得了可以降解苯酚的酶邻苯二酚加氧酶，并以双水相法加以提纯。结果显示，该假单胞菌经过发酵获得了邻苯二酚加氧酶，在双水相法萃取时选用PEG6000与不同体积的缓冲溶液融合后，只有当PEG6000与缓冲液体积为1/1.6时，上下相及混合相酶活才存在。本实验为以双水相法提取生物活性物质奠定了基础。引言：苯酚被大量用于制造酚醛树脂以及其他高分子材料、药物、燃料、炸药等。随着近年来工业对于苯酚的需求日益增加，苯酚对于环境的污染也日益加重［1］，这对人类也有极大的危害性。已有研究对微生物降解苯酚的途径进行了解释［2］，也有对邻苯二酚双加氧酶的结构和功能的研究的报道［3］。降解苯酚的代谢是将苯酚分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解，最后形成2-羟粘糠酸半醛。邻苯二酚加氧酶是降解本分的关键酶所以邻苯二酚加氧酶在降解苯酚的途径中起着重要的作用。虽然已经有以双水相萃取生物物质［4］的报道，但还没有以双水相发萃取邻苯二酚加氧酶的报道。自然界中，存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌。本实验从化学工厂的污水中分离出能够降解苯酚的假单胞菌。并以此菌进行发酵，并将发酵后的产物用双水相法进行分离、提纯出邻苯二酚加氧酶。开展本实验，可以为以降解苯酚的工程菌进行发酵、以双水相法萃取直接得到降解苯酚的关键酶奠定基础，以更加有效的方法改善污染。1材料与方法1.1材料供试菌为从污水中分离出的假单胞菌1.2培养基用假单胞菌生产邻苯二酚加氧酶过程中使用的培养基及组成见表1表1・假单胞菌各阶段培养基培养基种类 成份种子培养基富集培养培养基3gL-i牛肉膏+10gL-i蛋白胨+5gL-iNaCl+20gL-i(pH7.0)种子培养基富集培养培养基3gL-i牛肉膏+10gL-i蛋白胨+5gL-iNaCl(pH7.0)无机盐培养基 6gL-iNaHPO+3gL-iKHPO+0.5gL-iNaCl+1gL-iNHCl+200mgL-i酵母膏+0.24gL-iMgS02 4 2 4 4 4+0.011gL-1CaCl(pH6.5-6.8)发酵培养基 无机盐培养基+500mgL-i苯酚1・3菌液制备将已经分离得到的苯酚降解菌假单胞菌接到种子培养基上，在30°C下培养24h。之后将种子培养基上的菌体转接至装液量为50ml/250ml三角瓶中（10瓶/组），在37C下以200r/min摇瓶18h。在4-10C下以10000r/min的速度离心15min,共离心两次。将得到的菌泥进行碳饥饿培养。1・4苯酚降解菌的发酵培养、菌体细胞的收集及破碎50L的发酵罐中添加10L的发酵培养液，灭菌、冷却后将至的的接种液接入发酵罐里，30°C,1:1（v/v）通风量，搅拌速度为300r/min发酵培养24h。发酵液在10°C下10000r/min离心5min收集细胞菌泥。菌泥用磷酸盐缓冲液（pH7.5）冲洗两次，重选在10-50ml相同缓冲液中，在冰浴条件下超声破碎3min，功率300W,所得粗提物于4°C,10000r/min离心30min得上清液。1.5PEG6000与酶的共沉淀及复溶将酶粗提液在冰浴条件下先缓慢加入PEG6000并不断搅拌混合均匀，静置1h待PEG与酶混合稳定后再加入固体（NH4）2SO4至饱和，低温静置6小时。然后再4°C、1000r/min离心10min，得到PEG与蛋白质的盐析复合沉淀物。PEG与蛋白质的盐析复合沉淀物分成5份（分别为1号1.62g、2号1.60g、3号1.61g、4号1.58g、5号1.54g）,分别置于10ml离心管中按一定质量比加入pH7.5的O.lmol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解复合沉淀物（比例为沉淀/缓冲液=,1/0.8,1/1.6,1/2.0和1/2.4），经过3000转/每分钟离心5分钟形成不同组成相的PEG/磷酸盐双水相体系。1.6邻苯二酚加氧酶酶活力的测定配置100mg/L苯酚溶液。分别取10ml苯酚溶液+0.5ml酶液（对应5组双水相当中的、上相、下相、混合相）。利用液相色谱法分别测定酶解前的苯酚浓度［phe1］，在30C水浴经过一小时后测得酶解后苯酚浓度［phe2］。2结果2.1苯酚降解菌假单胞菌的活化在经过种子培养基的固体培养后，成功的使菌体活化长出菌落。菌落呈乳白色，形状不规则，是类圆形的多边形。菌落表面潮湿、光滑。（见图1）图1：假单胞菌在种子培养基上活化培养24h后形成的菌落2.2PEG6000与酶的共沉及复溶

经过不同缓冲体系的共沉及芙蓉后，邻苯二酚加氧酶及其他酶成功的在PEG6000与水的双水相中分离，得到了五种不同的双水相系统（见图2）。双水相萃取稳定分层后分离两相，分别测得上下相的体积比为2：1，1：1，2：3，1：2，1：3（顺序为从左到右一号管到五号管）。图2：五种不同的双水相系统复溶后酶在两相中分离情况2.3邻苯二酚加氧酶酶活力测定结果根据测定的结果，计算出相应的酶活，并计算出K值和Y值。（见表2）表2：五种不同双水相体系各相酶活及K值与Y值注：分配系数K，K=上相酶活力/下相酶活力上相(mg/L)下相(mg/L)混合相（mg/L）各相酶活（u/ml）K值Y下相上相下相混合相口号管[phel]l46.37427144.23427143.73793-1.53354-0.966729.641940.000.00[phe2]l47.l4l04144.71762128.91696二号管[phel]l42.59590143.79263142.785523.54640.586728.2221212.080.14[phe2]l40.82270143.49927138.61446三号管[phel]143.06677142.94801141.828670.18258-2.2436-2.564480.000.00[phe2]142.97548144.06981143.11091四号管[phel]145.32157140.70160143.87504-0.69862-8.3040610.248240.000.00[phe2]145.67088144.85363138.75092五号管[phel]146.60927144.54684143.14679-0.654443.45316-1.726760.000.00[phe2]146.93649142.82026144.01017下相酶的得率Y （%）Y（下相总酶活力/两相总酶活力）X100=CVX下相 下相 bb100/(CV+CV)=100/(1+KR)(2)aabb式(2)中：C为上相液酶浓度(U/mL),Cb为下相液酶浓度(U/mL),V为上相液体积(mL)aba3讨论本实验以苯酚降解菌假单胞菌成功发酵产生了所需的邻苯二酚加氧酶，并结合双水相技术提纯了该酶。双水相萃取技术是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相后，由于被分离物在两相中分配不同，从而实现分离的技术。与传统溶剂萃取相比，双水相萃取最大的优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的环境，在萃取过程中保持生物物质的活性及构象，而且双水相萃取还有收率高、成本低、可连续化操作等优点，现已被广泛的应用于生物化学产品的分离和提取，尤其在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化方面备受关注。分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质向来是一项艰巨的工作。由于蛋白质的市场价格昂贵，如能提高回收率将带来巨大的经济效益，所以有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策成为近年来研究的热点。在苏玉春[5]等做的实验中成功比较了不同双水相体系下的木聚糖酶的酶活，通过比较分离系数(K)和下相产率(Y)的值得出PEG4000提取效果最好。本实验使用的PEG6000分别在两相比例不同的情况下测得K与Y值，结果只得到当上下相体积相等时可以在两相及混合相中都测得酶活，而上相为第二管最高，下相为第五管最高，混合相中为第一管最高，可以得出在PEG6000与缓冲溶液比为1/1.6时，上相中的酶含量最多；当PEG6000与缓冲溶液比为1/2.4时，下相中酶含量最多；当PEG6000与缓冲溶液比为1/0.8时，混合相中酶含量最多。但仍有许多酶活测定为负值，无实际意义，即酶活为零。分析可能的原因是因为在发酵提取出酶后储存时间过长，影响了酶的活力。在吸取样品上下相测酶活时，样品不够均匀，使得取出的液体中酶含量过少。开展本实验为研究以双水相提纯生物活性物质的方法和条件等奠定了基础，并为以苯酚降解菌改善环境提出了新的可能性：以菌产物邻苯二酚加氧酶直接工业化生产。参考文献边归国•土壤中苯酚污染治理技术研究进展[J].青海环境,2007年第三期，第109-112页冯思琪魏炜袁雅姝张黎微生物降解苯酚的研究进展环