肾气虚状态下大鼠氧自由基损伤程度和端粒长度的变化

肾气虚状态下大鼠氧自由基损伤程度和端粒长度的变化

端粒是真核细胞中染色体末端的蛋白质-dna结构，在保护染色体完整性和维持细胞复制能力方面发挥着重要作用。随着连续细胞分裂，端粒逐渐缩小，细胞老化死亡。端粒长度目前已被公认为是观察人体衰老的微观指标。中医认为脾虚在衰老中占有重要地位,前期研究认为脾气虚是脾虚的早期状态。脾气虚则“脾失健运”导致免疫功能紊乱,代谢功能下降,“枢机不利”则导致自由基的损伤。而自由基损伤引起DNA共价键的断裂和链分离,端粒也不能幸免。本项研究以自由基损伤学说和端粒学说为切入点,通过观察脾气虚证模型大鼠脑皮质及血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)含量和脑皮质端粒长度的变化情况,为揭示脏象学说中脾气虚证的现代科学内涵提供新的科学事实和实验依据,为人类抗衰老提供新的防治手段。1材料和方法1.1dna提取试剂盒考马斯亮兰蛋白测定盒(南京建成生物工程研究所);SOD测定盒(南京建成生物工程研究所);GSH-PX测定盒(南京建成生物工程研究所);MDA测定盒(南京建成生物工程研究所);T-AOC测定盒(南京建成生物工程研究所);端粒长度检测试剂盒(Roche);DNA提取试剂盒(大连宝生物);带正电荷尼龙膜(美国密理博);杂交袋(Roche)。1.2方法1.2.1平均体重g健康SD雌性大鼠,由中国医科大学实验动物中心提供,平均体重(180.6±8.93)g。随机分为2组:正常对照组和脾气虚模型组,每组20只。1.2.2大鼠一般情况根据中医病因发病学理论,采用两种造模因素复合应用:(1)饮食不节:单日喂甘蓝,禁食,双日胃饲精炼猪油脂。(2)疲劳过度:游泳至耐力极限。第1~14d,单日喂食甘蓝,不限量,禁食,自由饮水,游泳至耐力极限(耐力极限系指大鼠四肢划动无力,身体竖立,整个头部浸入水中超过10s);双日胃饲猪油脂每只2mL/100g体重。第15d,应用模糊数学模式识别方法对脾气虚证模型大鼠进行综合评价,将符合标准的脾气虚证模型大鼠纳入脾气虚证模型组。1.2.3脑皮质组织的制备各组动物造模结束后,用10%水合氯醛按0.35mL/100g体重的剂量麻醉动物,用10mL注射器进行腹主动脉取血后,迅速取出脑皮质组织,用精密天平准确称量脑皮质组织重量,每个组织块按1∶9的比例加冰生理盐水充分匀浆,配制成10%的组织匀浆液,3000r/min离心10min后,取上清液置Eppendorf管中,放入-20℃冰箱保存备用。血液放置2h后,3000r/min离心10min后,取上清液放入Eppendorf管中,置-20℃冰箱保存备用。分别按照SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA试剂盒的操作步骤完成测定。1.2.4脑皮质dna的提取和纯化造模结束后,用10%水合氯醛按0.35mL/100g体重的剂量麻醉动物,在冰上迅速取出脑皮质组织各0.05~0.1mg,冰生理盐水洗去血液,滤纸吸干水分。(1)DNA提取:取0.05~0.1mg的脑皮质组织移入冰浴预冷的CollectionTube中,用研磨棒快速研磨成糊状;加入350μL的SolutionA和0.9μL的RNaseA1后用快速研磨成匀浆;充分振荡混匀后,65℃保温5min;加入400μL的SolutionB,振荡混合;加入1mL4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12000r/min离心2min;弃去上层有机相,再加入1mL的4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12000r/min离心2min;弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)转移至置于CollectionTube上的FilterCup中,12000r/min离心1min;弃FilterCup,在滤液中加入400μL的DBBuffer,混合均匀;将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上,将上述操作6混合溶液转移至CollectionTube中,12000r/min离心1min,弃滤液;将500μL的RinseA加入至SpinColumn中,12000r/min离心30s,弃滤液;将700μL的RinseB加入至SpinColumn中,12000r/min离心30s,弃滤液;重复操作步骤9;将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入50~200μL的灭菌蒸馏水,室温静置1min;12000r/min离心1min洗脱DNA。用蛋白核酸分析仪检测脑皮质DNA含量。(2)端粒长度的检测(Southern杂交):各检测样品分别取1μgDNA用限制性内切酶HinfI/RsaI各1μL,37℃消化2h;然后用1×TAE缓冲液制备0.8%琼脂糖凝胶(15cm×10cm),上样20μL,75V,电泳4h。然后将凝胶依次进行下列处理:0.25mol/LHCI脱嘌呤10min,去离子水漂洗2次;1.5mol/LNaCI、0.5mol/LNaOH中变性,去离子水漂洗2×15min;3mol/LNaCI、0.5mol/LTris-HCI(pH7.5)中和2×15min;采用毛细管转移法将DNA转移至正电荷尼龙膜上,用20×SSC做转移液,过夜;次日将膜放入两层滤纸之间,120℃烘烤20min;取出膜,在2×SSC中漂洗2次;将膜放入杂交袋,先加入预杂交液约18mL,轻摇孵育,42℃,50min;然后弃去预杂交液,立即加杂交液,轻摇孵育,42℃,3h(杂交液内含适量的以地高辛标记的寡核苷酸探针);然后用严紧型清洗缓冲液Ι漂洗杂交膜,100mL,2×5min;再用预热的严紧型清洗缓冲液Ⅱ漂洗杂交膜,100mL,50℃,2×15min;用100mL清洗缓冲液漂洗膜5min;将膜放在100mL阻断溶液中孵育30min;加入含Anti-Dig-Ap的工作液100mL孵育30min;用清洗缓冲液漂洗膜,200mL,2×15min;在100mL检测液中孵育膜2~5min;弃去检测缓冲液,将有DNA的一面向上平放,很快加入40滴(约30mL)底物溶液,驱除气泡,孵育5min;于暗室中将X线片覆盖在膜上,暗盒固定,曝光10~20min,用UV-2000紫外分析仪对显影后的X线片进行扫描,并用Gis-120D数码处理系统(上海天能)进行分析。用TRF=∑(ODi)/∑(ODi/Li)(ODi为杂交带i处光密度,Li为i处DNA分子大小)计算出端粒长度。1.3统计处理所有数据用x—±s表示。实验结果采用SPSS11.5版本进行处理。两组间均数比较采用t检验。2结果2.1gsh-px活性、gsh-aoc活性变化与正常组相比,脾气虚模型组大鼠血清和脑皮质中SOD活性显著降低(P<0.05),GSH-Px活性显著降低(P<0.05),T-AOC显著降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05)。见表1。2.2脾虚模型中大鼠段粒的长度变化脾气虚模型组大鼠脑皮质中端粒长度显著降低,与正常组比较有明显差异(P<0.05)。见表2。3油气虚证动物模型的制备端粒是近几年生命科学研究的热点。实验研究发现在某些组织中,老年人的端粒比年轻人的短,端粒长度已经成为衰老研究的主要微观指标。中医认为脾虚在衰老中占有重要地位。脾虚运化功能减退,水谷精微不能充分营养肢体,失去正常生理活动,导致衰老。现代很多实验研究也发现,在衰老的进程中,机体内的抗氧化系统逐步降低,并且自由基及其分解产物在体内积聚。因此端粒、氧自由基与脾虚相关的分子生物学机制之间可能存在着密切的关系。本项研究从脾气虚证出发,以饮食不洁,劳倦过度复合因素结合复制出脾气虚证动物模型。实验发现,与正常组相比,脾气虚模型组大鼠体内MDA含量显著升高(P<0.05),说明脾气虚状态下机体有明显的氧自由基损伤。生物体在其长期进化过程中,为防御氧自由基的损伤和破坏,组织和细胞建立了一整套完善的抗氧化防御系统,包括作为大分子清除剂的抗氧化酶系统和抗氧化物系统,如SOD、T-AOC、GSH-Px。实验发现,模型大鼠血清和脑皮质SOD、GSH-Px、T-AOC含量与正常组比较有显著下降(P<0.05)。本实验研究结果显示,脾气虚模型组大鼠脑皮质中端粒长度显著降低,且与正常对照组比较有